炎症性乳癌細胞の尾静脈注射による脳転移のモデル化
Summary
内因的にHER2増幅された炎症性乳癌細胞株の尾静脈注射によって生成された乳癌脳転移の異種移植マウスモデルについて説明します。
Abstract
脳への転移性転移は、多くの種類の癌の一般的で壊滅的な症状です。米国だけでも、毎年約20万人の患者が脳転移と診断されています。原発性乳がんおよび全身性悪性腫瘍の患者の生存転帰の改善において大きな進歩が見られました。しかし、臨床的脳転移患者の悲惨な予後は、この致命的な病気に対する新しい治療薬と戦略を開発する緊急の必要性を浮き彫りにしています。適切な実験モデルの欠如は、脳転移の生物学と治療の理解の進歩を妨げる主要なハードルの1つでした。ここでは、まれで侵攻性の乳がんである炎症性乳がん(IBC)に由来する内因性HER2増幅細胞株の尾静脈注射によって生じる脳転移の異種移植マウスモデルについて説明します。細胞をホタルルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質で標識して脳転移をモニターし、生物発光イメージング、蛍光実体顕微鏡、および組織学的評価によって転移負荷を定量化しました。マウスは頑健かつ一貫して脳転移を発症し、転移過程における主要なメディエーターの調査と新しい治療戦略の前臨床試験の開発を可能にします。
Introduction
脳転移は、全身性悪性腫瘍の一般的で致命的な合併症です。ほとんどの脳転移は、肺、乳房、または皮膚の原発腫瘍に由来し、これらをまとめて症例の67〜80%を占めています1,2。脳転移の発生率の推定値は100,000〜240,000例の間で変動し、転移性癌で死亡した患者では剖検がまれであるため、これらの数は過小評価されている可能性があります3。脳転移のある患者は、脳転移のない患者と比較して予後が悪く、全生存期間が低くなります4。脳転移に対する現在の治療選択肢は大部分が緩和的であり、ほとんどの患者の生存転帰を改善することができない5。したがって、脳転移は依然として課題であり、より効果的な治療法を開発するために、脳転移の進行メカニズムをよりよく理解することが引き続き急務です。
実験モデルの使用は、脳への乳がん転移進行の特定のメカニズムに関する重要な洞察を提供し、さまざまな治療アプローチの有効性の評価を可能にしました6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16.しかし、脳転移の発生の複雑さを正確かつ完全に再現できるモデルはほとんどありません。いくつかの実験的in vivoモデルは、同所性、尾静脈、心臓内、頸動脈内、および脳内注射を含む異なる投与経路によるマウスへの癌細胞の接種によって生成されている。各手法には、他の場所でレビューされているように、長所と短所があります 3.しかし、これらのマウスモデルのいずれも、脳転移の臨床的進行を完全に再現することはできません。
脳転移は、原発性乳がんのまれではあるが攻撃的な変異体である炎症性乳がん(IBC)の患者に特によく見られます。IBCは乳がん症例の1%から4%を占めていますが、米国では乳がん関連の死亡の不釣り合いな10%を占めています17,18。IBCは急速に転移することが知られています。実際、IBC患者の3分の1は診断時に遠隔転移を持っています19,20。脳転移に特異的なIBC患者は、非IBC21患者よりも脳転移の発生率が高い。最近、マウス異種移植片のIBCの特徴を再現するER-PR–/HER2+ IBC患者の悪性胸水に由来するMDA-IBC3細胞株が、尾静脈注射した場合、マウスの肺転移ではなく脳転移を発症する傾向が亢進することを示し、この細胞株は脳転移の発症を研究するための優れたモデルとなっています16。
ここでは、MDA-IBC3細胞の尾静脈注射を介して脳転移を生成し、立体蛍光顕微鏡およびルシフェラーゼイメージングを介して転移負荷を評価する手順について説明します。この方法は、脳への乳がん転移の主要なメディエーターを発見し、治療的介入の有効性をテストするために使用されています16、22、23。この技術の欠点は、脳転移過程のすべてのステップを再現しないことです。それにもかかわらず、その主な利点には、堅牢性と再現性、血管内投与の関連する転移生物学の関与、肺の横断と脳への血管外漏出、および技術の点での比較的単純さが含まれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれています。細胞は生存能力を維持するために1時間以内氷上に保たれるべきです。アルコール綿パッドを使用して、注射前にマウスの尾を拭き、尾の皮膚を傷つけないように強く拭きすぎたり、頻繁に拭いたりしないように注意する必要があります。マウスが血管塞栓で死亡するのを防ぐために、細胞懸濁液に気泡が存在しないことを確認…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿の科学的編集をしてくれたMDアンダーソンの放射線腫瘍学部門のクリスティンF.ウォーガン、MS、ELS、およびヘマトキシリンとエオジン染色の支援を提供してくれたMDアンダーソンの外科組織学コアのキャロルM.ジョンストンに感謝します。MDアンダーソンの獣医学および外科コアの動物実験への支援に感謝します。この研究は、次の助成金によってサポートされました:スーザンG.コーメンキャリアカタリスト研究助成金(CCR16377813からBGD)、アメリカ癌協会研究奨学生助成金(RSG-19–126–01からBGD)、およびテキサス州のまれで積極的な乳がん研究プログラム。また、国立がん研究所、国立衛生研究所からテキサス大学MDアンダーソンがんセンターへのがんセンターサポート(コア)助成金P30 CA016672によって部分的にサポートされています。
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
Referências
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