Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein
Summary
Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.
Abstract
La propagation métastatique au cerveau est une manifestation courante et dévastatrice de nombreux types de cancer. Rien qu’aux États-Unis, environ 200 000 patients reçoivent un diagnostic de métastases cérébrales chaque année. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’amélioration des résultats de survie des patientes atteintes d’un cancer du sein primitif et de tumeurs malignes systémiques; Cependant, le pronostic sombre pour les patients atteints de métastases cérébrales cliniques souligne le besoin urgent de développer de nouveaux agents thérapeutiques et stratégies contre cette maladie mortelle. Le manque de modèles expérimentaux appropriés a été l’un des principaux obstacles à l’avancement de notre compréhension de la biologie et du traitement des métastases cérébrales. Ici, nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire amplifiée endogène HER2 dérivée du cancer inflammatoire du sein (CIS), une forme rare et agressive de cancer du sein. Les cellules ont été marquées avec de la luciférase luciole et de la protéine de fluorescence verte pour surveiller les métastases cérébrales, et quantifiées la charge métastatique par imagerie par bioluminescence, stéréomicroscopie fluorescente et évaluation histologique. Les souris développent de manière robuste et cohérente des métastases cérébrales, ce qui permet d’étudier les médiateurs clés du processus métastatique et de développer des tests précliniques de nouvelles stratégies de traitement.
Introduction
Les métastases cérébrales sont une complication courante et mortelle des tumeurs malignes systémiques. La plupart des métastases cérébrales proviennent de tumeurs primaires du poumon, du sein ou de la peau, qui représentent collectivement 67 à 80 % descas1,2. Les estimations de l’incidence des métastases cérébrales varient entre 100 000 et 240 000 cas, et ces chiffres peuvent être sous-estimés car l’autopsie est rare chez les patients décédés d’un cancer métastatique3. Les patients présentant des métastases cérébrales ont un pronostic plus sombre et une survie globale plus faible par rapport aux patients sans métastases cérébrales4. Les options de traitement actuelles pour les métastases cérébrales sont en grande partie palliatives et ne parviennent pas à améliorer les résultats de survie pour la plupart des patients5. Ainsi, les métastases cérébrales restent un défi, et le besoin demeure pressant de mieux comprendre les mécanismes de progression des métastases cérébrales afin de développer des thérapies plus efficaces.
L’utilisation de modèles expérimentaux a fourni des informations importantes sur les mécanismes spécifiques de la progression métastatique du cancer du sein vers le cerveau et a permis d’évaluer l’efficacité de diverses approches thérapeutiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Cependant, très peu de modèles peuvent récapituler avec précision et intégralité les subtilités du développement des métastases cérébrales. Plusieurs modèles expérimentaux in vivo ont été générés par inoculation de cellules cancéreuses chez la souris par différentes voies d’administration, y compris les injections orthotopiques, veineuses de la queue, intracardiaques, artérielles intracarotides et intracérébrales. Chaque technique présente des avantages et des inconvénients, comme examiné ailleurs3. Aucun de ces modèles murins, cependant, ne peut reproduire complètement la progression clinique des métastases cérébrales.
Les métastases cérébrales sont particulièrement fréquentes chez les patientes atteintes d’un cancer inflammatoire du sein (CIS), une variante rare mais agressive du cancer du sein primitif. Le CIS représente 1% à 4% des cas de cancer du sein, mais il est responsable d’un pourcentage disproportionné de 10% des décès liés au cancer du sein aux États-Unis17,18. Le CIS est connu pour métastaser rapidement; en effet, un tiers des patients atteints de CIS présentent des métastases à distance au moment du diagnostic19,20. En ce qui concerne les métastases cérébrales, les patients atteints de CIS ont une incidence plus élevée de métastases cérébrales que les patients atteints de CIS21. Récemment, nous avons démontré que la lignée cellulaire MDA-IBC3, dérivée du liquide d’épanchement pleural malin d’un patient atteint d’un IBC ER/PR-/HER2+ qui récapitule les caractéristiques du CIS dans les xénogreffes de souris, a une propension accrue à développer des métastases cérébrales plutôt que des métastases pulmonaires chez la souris lorsqu’elles sont injectées par la veine de la queue, faisant de cette lignée cellulaire un bon modèle pour étudier le développement des métastases cérébrales16.
Nous décrivons ici les procédures permettant de générer des métastases cérébrales par injection de cellules MDA-IBC3 dans la veine de la queue et d’évaluer la charge métastatique par microscopie stéréofluorescente et imagerie par luciférase. Cette méthode a été utilisée pour découvrir les médiateurs clés des métastases du cancer du sein au cerveau et pour tester l’efficacité des interventions thérapeutiques 16,22,23. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne récapitule pas toutes les étapes du processus métastatique cérébral. Néanmoins, ses principaux avantages comprennent la robustesse et la reproductibilité, l’implication de la biologie des métastases pertinentes de l’intravasation, la traversée des poumons et l’extravasation dans le cerveau, et sa relative simplicité en termes de technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole comprend plusieurs étapes critiques. Les cellules ne doivent pas être conservées sur la glace plus de 1 heure pour maintenir leur viabilité. Des tampons de coton alcoolique doivent être utilisés pour essuyer la queue des souris avant l’injection, en prenant soin de ne pas essuyer trop fort ou trop souvent pour éviter d’endommager la peau de la queue. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans la suspension cellulaire, pour empêcher les souris de mourir des emboles des vaisseaux…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Christine F. Wogan, MS, ELS, de la Division de radio-oncologie de MD Anderson pour la révision scientifique du manuscrit, et Carol M. Johnston de la Division d’histologie chirurgicale de MD Anderson pour son aide avec la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Nous sommes reconnaissants envers le noyau de médecine et de chirurgie vétérinaires de MD Anderson pour son soutien aux études sur les animaux. Ces travaux ont été financés par les subventions suivantes : Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 à BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 à BGD) et State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Également soutenu en partie par Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 du National Cancer Institute, National Institutes of Health, au MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
Referências
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