Summary
Здесь предусмотрен протокол для покадровой визуализации морфогенеза глаза с использованием коммерчески доступного светового микроскопа и рабочей станции обработки изображений для анализа полученных данных. В этом протоколе подробно описываются процедуры анестезии эмбрионов, встраивание агарозы с низкой температурой плавления, суспензия в камере визуализации, настройка параметров визуализации и, наконец, анализ данных визуализации с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
Abstract
Развитие глаза позвоночных является сложным процессом, который начинается ближе к концу гаструляции эмбриона и требует точной координации миграции клеток, пролиферации и дифференцировки. Покадровое воображение дает уникальное представление о поведении клеток во время развития глаз, потому что оно позволяет нам визуализировать окулогенез in vivo. Рыбки данио являются отличной моделью для визуализации этого процесса из-за их высококонсервированного глаза позвоночных и их способности быстро и внешне развиваться, оставаясь оптически прозрачными. Покадровые исследования развития глаз рыбок данио значительно облегчаются использованием трансгенной линии рыбок данио Tg(rx3: GFP). В развивающемся переднем мозге экспрессия rx3: GFP отмечает клетки одного глазного поля, и GFP продолжает экспрессироваться, когда глазное поле уклоняется, образуя зрительный пузырь, который затем инвагинируется, образуя оптическую чашку. Таким образом, покадровая визуализация экспрессии rx3: GFP с высоким разрешением позволяет нам отслеживать примордий глаза во времени, когда он развивается в сетчатку. Световой микроскопия является идеальным методом для изображения глазного морфогенеза с течением времени из-за его способности проникать в более толстые образцы для флуоресцентной визуализации, минимизировать фотоотбеливание и фототоксичность, а также изображение на высокой скорости. Здесь предусмотрен протокол для покадровой визуализации морфогенеза глаза с использованием коммерчески доступного светового микроскопа и рабочей станции обработки изображений для анализа полученных данных. В этом протоколе подробно описываются процедуры анестезии эмбрионов, встраивание агарозы с низкой температурой плавления, суспензия в камере визуализации, настройка параметров визуализации и, наконец, анализ данных визуализации с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Полученный набор данных может дать ценную информацию о процессе морфогенеза глаз, а также о возмущениях этого процесса в результате генетической мутации, воздействия фармакологических агентов или других экспериментальных манипуляций.
Introduction
Эмбриональное развитие является сложным процессом, который требует точной координации множества различных событий. Формирование глаза позвоночных начинается в развивающемся переднем мозге, где часть клеток указывается как поле глаза. Эти клетки будут уклоняться к поверхностной эктодерме, давая начало двум двусторонним зрительным везикулам 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Контакт с поверхностной эктодермой затем индуцирует инвагинацию зрительного пузырька в оптическую чашку. Поверхностная эктодерма будет давать начало передним структурам глаза, таким как хрусталик и роговица, в то время как оптическая чашечка даст начало нервной сетчатке и пигментированному эпителию сетчатки и сетчатки 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Нарушения в этом процессе могут привести к врожденным дефектам, таким как микрофтальмия, анофтальмия и колобома (MAC). В настоящее время нет вариантов исправления этих дефектов 3,5,6,7,9,10,11,12. Дальнейшие исследования механизмов морфогенеза глаз и проблем, которые могут привести к МАК, обеспечат основу знаний, которые потенциально приведут к лечению. Одним из мощных инструментов для исследования динамического поведения клеток во время развития глаз является покадровое воображение, которое позволяет визуализировать и характеризовать этот процесс in vivo и в режиме реального времени.
Рыбки данио (Danio rerio) являются отличной моделью для визуализации раннего развития глаз с использованием покадровой визуализации. Они имеют высокосохраненный глаз позвоночных и обладают способностью быстро и внешне развиваться, оставаясь оптически прозрачными1. Рыбки данио обеспечивают отличный ресурс для покадровой визуализации из-за этих характеристик, которых не хватает моделям млекопитающих. Покадровые исследования развития глаз рыбок данио значительно облегчаются использованием трансгенной линии рыбок данио Tg(rx3: GFP)13. Rx3 (гомеобоксный белок сетчатки 3) является транскрипционным фактором, необходимым для развития глаз14. Rx3 является первым из трех генов rx у рыбок данио, которые экспрессируются, начиная свою экспрессию в середине гаструляции, примерно через 8 ч после оплодотворения (hpf) 15,16. Трансген rx3:GFP может быть визуализирован в развивающемся переднем мозге, начиная с 1 стадии сомита (ss), примерно 10 л.с. 15,17,18,19,20. В развивающемся переднем мозге экспрессия rx3:GFP отмечает клетки одного глазного поля, а GFP (зеленый флуоресцентный белок) продолжает экспрессироваться через оставшуюся часть глазного морфогенеза. Таким образом, покадровая визуализация экспрессии rx3: GFP с высоким разрешением позволяет нам отслеживать одно поле глаза во времени, когда оно развивается в сетчатку 17,18,20.
Покадровые исследования развития рыбок данио в основном проводились с использованием конфокальной или световой микроскопии. Конфокальная микроскопия выгодна тем, что она позволяет точно визуализировать образцы вдоль оси Z и уменьшает флуоресцентный фоновый сигнал. Однако он ограничен количеством времени, необходимого для получения изображения, жесткостью положения образца и его склонностью к фотоотбеливанию и фототоксичности живых образцов. Световой микроскопия является идеальным методом для изображения глазного морфогенеза с течением времени благодаря его способности проникать в более толстые образцы для флуоресцентной визуализации, повышенной гибкости в ориентации образцов, минимизации фотоотбеливания и фототоксичности, а также визуализации на высокой скорости 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Пространственное разрешение, достижимое с помощью современных систем световой листовой микроскопии, составляет примерно 250-500 нанометров (нм). Хотя это существенно не отличается от того, что может быть получено с помощью конфокальной микроскопии, образец можно свободно поворачивать и визуализировать под несколькими углами, улучшая как глубину изображения, так и разрешение, и предлагая гораздо большую гибкость для экспериментов по покадровой визуализации in vivo, чем конфокальная платформа27,32 . По этим причинам микроскопия Lightsheet быстро становится предпочтительным методом для покадровых исследований развития рыбок данио. Этот протокол описывает этапы количественной оценки окулогенеза посредством визуализации трансгенных рыбок данио Rx3: GFP с использованием коммерчески доступного микроскопа Lightsheet33 и детализирует конвейер для анализа изображений с использованием программной платформы arivis.
Protocol
Все эксперименты, связанные с использованием рыбок данио, проводились в соответствии с протоколами, установленными Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета Кентукки (IACUC).
1. Пробоподготовка
- Установите спаривающуюся пару рыбок данио Tg(Rx3: GFP) в закрытом поперечном резервуаре в ночь перед планированием визуализации. На следующее утро потяните за ворота, когда загорается свет в рыбном хозяйстве34,35.
ПРИМЕЧАНИЕ: Брачная пара выбранных рыб должна быть в возрасте от 4 месяцев до 2 лет и легко различаться как самец или самка на основе формы тела и окраски35. - Проверяйте кресты каждые полчаса на наличие эмбрионов и отмечайте, в какое время эмбрионы впервые визуализируются в нижней части крестового резервуара. Перенесите эмбрионы в чашку Петри и поддерживайте эмбрионы при температуре 28,5 °C в течение примерно 10 ч, чтобы развиться до 1-2 стадии сомита (ss). Начинают изображать на стадии 1-2 сомита (сс).
- Чтобы проверить наличие сомитов, наблюдайте за эмбрионами под стереоскопом при 10 л.с. и подсчитывайте количество сомитов1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые эмбрионы, которые находятся за пределами одной стадии сомита, не должны использоваться для этого эксперимента. - Из эмбрионов, которые находятся на стадии одиночного сомита, экран для экспрессии GFP с использованием флуоресцентного адаптера в сочетании со стереомикроскопом для подтверждения присутствия трансгена Rx3: GFP. После того, как 3-5 GFP-положительных людей были идентифицированы, используйте тонкие щипцы для дехорионации эмбрионов и перенесите их в небольшую чашку Петри, содержащую буфер эмбрионов E3 со стеклянной пипеткой35.
- Обезболивают эмбрионы путем переноса их в буфер эмбриона E3 объемом 0,5 мл (рН 7), содержащий 0,168 мг/мл трикаина (MS222) в микроцентрифужной трубке35,36. Спонтанные мышечные движения начинаются уже при 17 л.с.37. Убедитесь, что эмбрионы обезболены для изображения за пределами этой временной точки.
- Встраивают эмбрионы в 1% агарозу с низкой температурой плавления в 0,168 мг/мл трикаина и Е3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптимальная концентрация агарозы с низкой температурой плавления, позволяющая эмбриону удерживаться на месте, но оставаться достаточно податливым, чтобы обеспечить рост эмбриона в течение времени визуализации30,31. - Готовят 10 мл раствора 2% агарозы низкой температуры плавления в буфере Е3. Разогрейте его в микроволновой печи для растворения агарозы с интервалом 15 с, чтобы раствор не закипел. Дайте раствору достаточно остыть, чтобы держать без дискомфорта, но не настолько, чтобы он затвердел, и не нанес бы вреда эмбрионам. Как только агароза достаточно остынет, добавьте 0,5 мл к эмбрионам в пробирке трикаина в Е3 и осторожно пипетируйте раствор и эмбрионы для смешивания.
- Используя стеклянный капилляр толщиной 1 мм и плунжер из политетрафторэтилена (PTFE), подтяните эмбрионы в растворе агарозы в капилляр. Убедитесь, что вытянули в общей сложности 3-5 эмбрионов (несколько эмбрионов) в капилляр, чтобы увеличить вероятность наличия хорошо расположенного эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за круглого характера эмбрионов в этот момент времени трудно гарантировать конкретную ориентацию в капилляре. В идеале тело эмбриона должно быть расположено латерально в капилляре, что обеспечивает наибольшую легкость позиционирования в микроскопе. - Дайте агарозе затвердеть в течение 30-60 с при комнатной температуре. Поместите капилляр в стакан с 0,168 мг/мл трикаина в буфер E3 до готовности к изображению (рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток 2% раствора агарозы с низкой температурой плавления можно дать затвердеть и впоследствии повторно нагреть в будущих экспериментах. - Поместите капилляр в держатель образца (рисунок 1B-F), как описано на шаге 2.5.
2. Установка Zeiss Lightsheet Z.1
- Включите каждый компонент микроскопа и компьютера в следующем порядке: 1) Система, 2) ПК, затем 3) Инкубация (Рисунок 2А).
- Поместите 20-кратный объектив для визуализации и 10-кратный объектив с подсветкой в камеру микроскопа. Сопоставьте целевые настройки в интерфейсе Zen Software на вкладке Сопровождение .
- Сдвиньте камеру (рисунок 2C) в корпус на дорожке (рисунок 2B) с трубкой, обращенной наружу. Трубка подключается к соответствующим портам справа, как показано на рисунке 2E.
- Прикрепите удлинительную линию к шприцу с помощью механизма luer-lock (рисунок 2D); заполните его трикаином в E3 и поместите в держатель, прикрепленный справа от микроскопа35. Соедините удлинитель, прикрепленный к шприцу, заполненному трикаином в E3, в правом нижнем углу камеры с помощью механизма luer-lock. Нажмите на плунжер, чтобы заполнить камеру буфером Tricaine/E3. Закройте дверь в камеру.
- Поместите капилляр вместе с образцом в держатель капиллярного образца. Капиллярный держатель образцов содержит две резиновые втулки, металлический диск держателя образца, металлический стержень и металлический колпачок (фиг.1B). Щелкните металлическую оболочку в центре металлического диска (рисунок 1С). Поместите две резиновые пробки в оболочку, при этом щели обращены к концам оболочки, а затем к капилляру. Проведите капилляром через середину резиновых пробок. Закрепите его на месте металлическим колпачком, как только маркер окажется у основания металлической оболочки (рисунок 1D).
- Поместите держатель капиллярного образца на верхнюю часть микроскопа, выровняв белые метки (рисунок 1E, F). Закройте крышку.
- Нажмите на кнопку Locate Capillary на интерфейсе программного обеспечения (рисунок 3A). Используйте панель управления ErgoDrive, ручное устройство, которое управляет ориентацией капилляров (рисунок 3E), чтобы переместить капилляр и расположить его чуть выше цели (рисунок 3B).
- Откройте крышку и осторожно надавите на поршень до тех пор, пока участок агарозы, содержащий эмбрион, не будет висеть ниже дна капилляра и не окажется перед целью (рисунок 3C).
- Отключите функцию Locate Capillary (Найти капилляр) и нажмите кнопку Locate Sample (рисунок 3A). Это переключает вид с веб-камеры камеры образца на объектив микроскопа (рисунок 3D). Используйте это представление для более точной настройки положения образца. Отключите параметр Locate Sample (рисунок 3A).
- Перейдите на вкладку Приобретение . Установите флажки Z-Stack и Time Series.
- В окне Параметры режима получения выберите параметр Dual Side Lightsheet и установите флажки Online Dual Side Fusion и Pivot Scanning.
- В окне Каналы выберите канал 488, установите мощность лазера равным 1, а время экспозиции — 7,5 мс.
- Затем нажмите кнопку «Непрерывно », чтобы получить живой вид эмбриона. Используйте панель управления ErgoDrive, чтобы настроить положение эмбриона до тех пор, пока поле глаз не окажется непосредственно лицом к камере. Продолжайте настраивать левую и правую световые таблицы в параметрах каналов, пока поле глаз не будет достаточно сфокусировано.
- Задайте параметры Z-Stack с помощью панели управления ErgoDrive для перемещения по Z-плоскости. Установите первую и последнюю Z-позиции примерно на 500 мкм от последнего обнаруживаемого флуоресцентного сигнала. Это оставляет место для глазного поля, чтобы оставаться в кадре, поскольку эмбрион растет в течение всего сеанса покадровой визуализации. После установки диапазона Z-Stack нажмите кнопку Optimal (Оптимальный ), чтобы установить размер шага на 0,477 мкм, оптимальную настройку.
- Установите параметры инкубации , установив флажок для блока Пельтье, чтобы поддерживать температуру на уровне 28 °C. В окне Временные ряды выберите частоту и временной интервал для получения изображений. В этом протоколе параметры были установлены на изображение каждые 5 минут, в общей сложности 166 интервалов.
- Нажмите кнопку Начать эксперимент . Выберите папку для сохранения набора изображений. Установите префикс изображения и нажмите Сохранить , чтобы запустить образ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь микроскоп будет проходить через каждый набор изображений с указанным интервалом. - После завершения сеанса покадровой визуализации отправьте сцену в положение нагрузки и извлеките держатель капиллярного образца. Разберите держатель капиллярного образца в обратном порядке, в котором он был собран вместе, и используйте плунжер для удаления образца и избытка агарозы из капилляра. Откройте дверцу камеры. Используйте шприц, чтобы удалить жидкость из камеры, отсоедините и удалите камеру, затем промойте водой и высушите воздухом.
3. Анализ изображений
- Откройте программу arivis Vision4D.
- Нажмите «Файл», затем выберите «Импортировать файл». Выберите все CZI-файлы из сеанса покадровой обработки изображений и откройте. Откроется следующее окно с опциями по импорту файлов; выберите Z-стеки в качестве Фреймов, чтобы упорядочить z-стеки в полученном порядке. После импорта файлов программное обеспечение сохраняет их в виде одного SIS-файла. Чтобы указать расположение сохраняемого файла, выберите папку перед нажатием кнопки Импорт.
- После импорта файла arivis готов к рендерингу видео с покадровыми изображениями. Нажмите на куб 4D Viewer в левом нижнем углу и значок Scale Bar (рисунок 4D-E). Нажмите на значок видео, чтобы переместить панель задач Storyboard в нижнюю часть экрана (рисунок 4C).
- На панели задач Раскадровка выберите Добавить последовательность ключевых кадров (рисунок 4F). Укажите продолжительность видео в секундах, снимите флажок Создать поворот и установите флажок Использовать прогрессию времени , чтобы включить определенные временные точки в видео. Программа отображает эти параметры справа от панели задач Storyboard для любых настроек в любое время. Сохраните раскадровку, чтобы применить одни и те же параметры к нескольким наборам изображений (рисунок 4F).
- Нажмите «Экспортировать фильм », чтобы сохранить видео покадрового изображения (рисунок 4F). Укажите параметры экспорта фильма, включая имя и расположение файла, формат видео (.mp4), разрешение видео (1 080 р), частоту кадров (60 кадров в секунду) и разрешение данных (1 297 x 1 297 x 784). При желании добавьте сюда метки времени. После установки этих параметров выберите Запись (рисунок 4F).
- Шаги 3.4 и 3.5 могут быть повторены с модификацией шага 3.4 для создания видеороликов поворота в определенные моменты времени. При добавлении последовательности ключевых кадров в раскадровку установите флажок Создать поворот и снимите флажок Использовать прогрессию времени. Затем следуйте тем же инструкциям, что и на шаге 3.5.
- Чтобы отобразить изображение с высоким разрешением в любой ориентации в любой момент времени, щелкните значок «Камера» в 4D Viewer, чтобы получить изображение с высоким разрешением (рисунок 4C).
- Чтобы построить конвейер для анализа, выберите значок Flask для доступа к панели Analysis (рисунок 4B). На панели «Анализ » щелкните раскрывающееся меню Операции анализа . В качестве примера протокол демонстрирует ниже последовательность операций для конвейера анализа объема. Выполните или отмените каждый шаг конвейера по отдельности, чтобы точно настроить каждый параметр (таблица 1).
- Щелкните синий треугольник в верхней части конвейера, чтобы разрешить работу конвейера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет некоторое время в зависимости от скорости компьютера. После оптимизации конвейера его можно легко экспортировать и импортировать в arivis и применять к нескольким наборам данных в пакетном анализе. - Чтобы получить доступ к пакетному анализу, щелкните Пакетный анализ на вкладке Анализ .
- После запуска конвейера появляется окно со всеми найденными объектами. Получите доступ к нему вручную через значок Table (рисунок 4B). В верхней части этого окна щелкните поле Столбцы компонентов , чтобы открыть список объектов, которые могут предоставить информацию об интересующем объекте. Для анализа объема поля глаз эти функции включают площадь поверхности, объем (объем, voxelCount), интенсивность No 1 (среднее), атрибуты (идентификатор, тип) и точку времени (первая). Нажмите « Экспорт», чтобы экспортировать данные в электронную таблицу.
Representative Results
Набор данных, отображаемый здесь, был сфотографирован с использованием протокола, описанного выше. Эмбрион Tg(Rx3:GFP) был визуализирован начиная с стадии 1 сомита (ss) до 24 hpf, общий период времени 14 ч, с изображениями, полученными с интервалом в 5 минут. Покадровая визуализация позволяет легко выбирать и сравнивать любую точку времени, которая показывает интересующий фенотип. На рисунке 5 показан набор изображений с высоким разрешением, которые были отрисованы с дорсальной точки обзора в выбранных точках времени разработки. Конвейер, запущенный в arivis Vision4D, создает маску, которая представляет развивающийся глаз, идентифицированный флуоресцентным сигналом. На рисунке 5 и видео 1-6 маску можно визуализировать по сравнению с флуоресцентным рендерингом развивающегося глаза. Кроме того, в таблице 2 отображаются объемные данные от развивающегося глаза в каждой точке визуализации. Этот набор данных включает в себя имя сегмента, идентификатор, объем как в мкм3, так и в количестве вокселя, среднюю интенсивность флуоресценции объекта, точку времени, в течение которой объект был идентифицирован, и площадь поверхности объекта в мкм2. Важно отметить, что когда глазное поле разделяется на две зрительные везикулы (начиная с точки времени 64), остается третья область, которая является положительной Rx3: GFP в переднем мозге, которая будет способствовать гипоталамусу 38,39,40 (рисунок 5D-M). Это проявляется в объемных данных, представленных в таблице 2 (выделенных желтым цветом, начиная с точки времени 71), и может быть легко отделено от оптических пузырьков, поскольку они намного меньше по объему, чем любой оптический пузырь.
Рисунок 1: Пробоподготовка. (А) Позиционирование эмбрионов в стеклянном капилляре. Стрелка указывает на эмбрион в капилляре. (B) Стеклянные капиллярные и капиллярные держатели частей. (C) Частично собранный капиллярный держатель. (D) Полностью собранный капиллярный держатель. (E) Монтажная камера lightsheet. Стрелка обозначала белую линию, используемую для ориентации капиллярного держателя. (F) Капиллярный держатель, правильно установленный в световом листе. Стрелка показывает соответствующие белые линии, указывающие на правильную ориентацию капиллярного держателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка изображения светового листа. (A) Коммутатор для включения Lightsheet, компьютера и инкубационного блока. Цифры обозначают порядок операций. (B) Объективная камера lightsheet. (C) Камера визуализации. (D) Шприц и трубка, которые будут подключены к камере визуализации. (E) Камера визуализации, правильно расположенная внутри камеры объектива, со всеми трубками, соединенными с соответствующими портами справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Позиционирование образца. (A) Кнопки «Найти капилляр» и «Найти образец» в программном обеспечении Zen, как указано стрелками. (B) Позиционирование на стеклянном капилляре. Стрелка указывает на край стеклянного капилляра, расположенного чуть выше линзы объектива. (C) Суспензия эмбриона за пределами стеклянного капилляра. Стрелка указывала на эмбрион, подвешенный в агарозе под стеклянным капилляром перед линзой объектива. (D) Взгляд на эмбрион через цель. (E) Панель управления ErgoDrive. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Важные иконки для навигации по arivis Vison4D. Каждая панель имеет функцию значка, обозначенную слева направо. (A) Открыть, Сохранить, Закрыть. (B) Панель анализа, Показать таблицу объектов, Открыть редактор треков. (C) Скопируйте текущее содержимое средства просмотра в виде изображения в буфер обмена, Переключить закладки, Создать изображение с высоким разрешением для текущего представления, Переключить раскадровку. (D) Показать поле измерения, Показать крест ориентации, Показать легенду, Показать шкалу. (E) Показать как 2D-просмотрщик, Показать как средство просмотра галереи, Показать как 4D-средство просмотра, Показать как средство просмотра информации, Показать как средство просмотра проекции. F) Обновить все ключевые кадры, Добавить ключевой кадр, Добавить последовательность ключевых кадров, Вставить ключевой кадр, Удалить все ключевые кадры, Экспорт фильма, Загрузить раскадровку, Сохранить раскадровку, Настроить целевое время всего фильма, Первый ключевой кадр, Воспроизведение, Пауза, Остановка, Последний ключевой кадр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Изображения с высоким разрешением и маски поля глаз. (A-M) Набор изображений с высоким разрешением, которые были отрисованы с дорсальных точек обзора; (A'-M') маски поля глаз для каждой соответствующей точки времени. Каждый набор изображений обозначается временем, когда он был получен с начала визуализации, и соответствующей стадией развития в стадии сомита (ss) или часах после оплодотворения (hpf). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Покадровое видео эмбриона рыбки данио Tg(rx3:GFP) от 1 ss-24 hpf. Пожалуйста, щелкните правой кнопкой мыши здесь, чтобы загрузить видео (сохраните ссылку как).
Видео 2: Покадровое видео эмбриона рыбки данио Tg(rx3:GFP) от 1 ss-24 hpf с глазным полем, идентифицированным конвейером arivis Vision4D. Пожалуйста, щелкните правой кнопкой мыши здесь, чтобы загрузить видео (сохраните ссылку как).
Видео 3: Вращение на 360° эмбриона рыбки данио Tg(rx3:GFP) за 1 сс. Пожалуйста, щелкните правой кнопкой мыши здесь, чтобы загрузить видео (сохраните ссылку как).
Видео 4: Поворот на 360° маски глаз эмбриона рыбки данио Tg(rx3:GFP) при 1 сс. Пожалуйста, щелкните правой кнопкой мыши здесь, чтобы загрузить видео (сохраните ссылку как).
Видео 5: Поворот на 360° эмбриона рыбки данио Tg(rx3:GFP) при 24 л.с. Пожалуйста, щелкните правой кнопкой мыши здесь, чтобы загрузить видео (сохраните ссылку как).
Видео 6: Поворот на 360° маски глаз эмбриона рыбки данио Tg(rx3:GFP) при 24 л.с. Пожалуйста, щелкните правой кнопкой мыши здесь, чтобы загрузить видео (сохраните ссылку как).
Таблица 1: Конвейер arivis Vision4D для объемного анализа развивающегося поля глаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Объем и площадь поверхности развивающегося поля глаза, приобретенного arivis Vision4D. Ряды, относящиеся к предполагаемому гипоталамусу, выделены желтым цветом, чтобы отличить их от зрительных пузырьков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Discussion
В этом протоколе микроскоп Lightsheet использовался для выполнения покадровой визуализации развития глаз, и полученные данные были проанализированы. Полученный набор данных может дать ценную информацию о процессе морфогенеза глаз, а также о нарушениях этого процесса в результате генетической мутации, воздействия фармакологических агентов или других экспериментальных параметров. Здесь протокол продемонстрировал, как можно получить этот набор данных, и предоставил пример того, как анализировать объем глазного поля на ранней стадии развития. Было установлено, что эти данные воспроизводимы и последовательны (менее 10% вариаций объема) среди биологических реплик, учитывая, что небольшие различия в стадии эмбриона до начала пробега могут привести к некоторым изменениям в окончательных измерениях объема.
Следует проявлять осторожность при первоначальном позиционировании эмбриона в капилляре и при позиционировании внедренного эмбриона перед целью. Ориентация играет важную роль в предотвращении роста эмбриона и выхода из поля зрения цели. Эмбрионы имеют круглую форму при 10 л.с.ф., что затрудняет гарантию определенной ориентации в капилляре. В идеале тело эмбриона будет располагаться латерально в капилляре. Загрузка нескольких эмбрионов в капилляр увеличит вероятность наличия хорошо расположенного эмбриона.
В этой процедуре эмбрион встраивается в агарозу, чтобы подвешивать ее перед целями визуализации и освещения. Выбор правильной концентрации агарозы с низкой температурой плавления имеет решающее значение. Слишком высокая концентрация будет сжимать эмбрион и препятствовать его правильному развитию; слишком низкая концентрация приведет к тому, что агароза развалится и не удержит эмбрион. Оптимальной для данного протокола концентрацией является конечная концентрация 1% с низкой температурой плавления агарозы30,31.
Еще одним элементом, который следует учитывать, является уровень насыщенности. По мере роста и дифференциации глаз сила сигнала Rx3:GFP усиливается. Поэтому при установке начальных параметров изображения экспозиция и мощность лазера должны быть уменьшены, чтобы перенасытить изображение. Это предотвратит перенасыщение изображения, поскольку Rx3: GFP со временем становится ярче. Изменения могут быть сделаны для исправления недостаточной насыщенности в обработке изображений, но перенасыщение не может быть исправлено после получения изображений.
Существует несколько дополнительных изменений, которые могут быть внесены в этот протокол, которые могут быть полезны для некоторых проектов, которые не описаны в этом документе. Например, можно настроить многовидную визуализацию в настройке получения изображения. Этот параметр позволит последовательно визуализировать несколько эмбрионов в разных положениях вдоль оси Y на каждом временном интервале. Усложняя набор данных, это увеличило бы скорость сбора данных. Кроме того, с точки зрения обработки изображений, можно количественно оценить поле глаза по другим параметрам. Здесь мы описали, как количественно оценить данные с точки зрения объема поля глаза. В качестве альтернативы может быть сделан конвейер для количественной оценки и отслеживания отдельных клеток или определения скорости эвагинации зрительных пузырьков.
Как упоминалось ранее, как конфокальная, так и Lightsheet микроскопия использовались для выполнения покадровых исследований изображений рыбок данио. Lightsheet был специально выбран для этого проекта из-за его превосходной способности к изображению через толстый (>1 мм) образец, потому что он оснащен инкубационной установкой для поддержания идеальной температурной среды для эмбриона рыбки данио, и потому, что его способность получать изображения с более высокой скоростью, чем конфокальная микроскопия, позволяет получать изображения через многочисленные промежутки времени, необходимые для этого протокола, без сопутствующего повреждения или фотоотбеливания эмбриона21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Также важно отметить, что микроскоп Lightsheet оснащен для изображения сигнала от нескольких флуорофоров. Микроскоп Lightsheet, используемый в этом исследовании, имеет твердотельные лазерные линии возбуждения на 405, 445, 488, 515, 561 и 638 нм, которые могут быть полезны для визуализации трансгенных эмбрионов, экспрессирующих более одного флуоресцентного репортерного трансгена.
В то время как этот протокол детализирует инструкции по анализу получения изображений, в частности, с использованием системы микроскопов с двойным освещением Lightsheet Z.1 и аналитического программного обеспечения arivis Vision4D, существуют другие коммерчески доступные микроскопы Lightsheet, изготовленные Leica, Olympus и Luxendo, а также программное обеспечение для анализа изображений Imaris, которые могут быть использованы для достижения аналогичных результатов. Выбор оборудования и программного обеспечения для этого протокола определялся наличием в нашем учреждении.
Таким образом, ожидается, что этот протокол обеспечит прочную отправную точку для проведения покадровой визуализации с использованием микроскопии Lightsheet и для количественной оценки изображений раннего развития глаз у рыбок данио.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны Управлением директора Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером S10OD020067 и наградой NIH R01EY021769 (A.C.M.). Мы благодарны за помощь Дугу Харрисону и Джиму Бегли в Центре визуализации искусств и наук при Университете Кентукки, а также Лукасу Виейре Франциско и Эвелин М. Тернбо за экспертный уход за рыбками данио.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 | |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 | |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d | |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO | |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | |||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 | |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 | |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | ||
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 | |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | ||
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 | |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | ||
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Wilson, S. W., Houart, C.
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
- Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
- Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
- Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
- Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
- Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
- Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
- Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
- Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
- Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
- Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
- Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).
