Summary

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Published: March 20, 2021
doi:

Summary

Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l’utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per visualizzare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie. Questo approccio può mappare le forze recettoriali >4.7pN in tempo reale e può integrare le forze nel tempo.

Abstract

Le forze meccaniche trasmesse alla giunzione tra due cellule vicine e alla giunzione tra le cellule e la matrice extracellulare sono fondamentali per regolare molti processi che vanno dallo sviluppo all’immunologia. Pertanto, lo sviluppo di strumenti per studiare queste forze su scala molecolare è fondamentale. Il nostro gruppo ha sviluppato una suite di sensori di tensione molecolare per quantificare e visualizzare le forze generate dalle cellule e trasmesse a ligandi specifici. La classe più sensibile di sensori di tensione molecolare è costituita da forcine ad anello stelo di acido nucleico. Questi sensori utilizzano coppie fluoroforo-quencher per segnalare l’estensione meccanica e lo sviluppo delle forcine del DNA sotto forza. Una sfida con i sensori di tensione a forcina del DNA è che sono reversibili con un rapido ripiegamento della forcina al termine della tensione e quindi le forze transitorie sono difficili da registrare. In questo articolo, descriviamo i protocolli per la preparazione di sensori di tensione del DNA che possono essere “bloccati” e impediti di ripiegarsi per consentire la “memorizzazione” di informazioni meccaniche. Ciò consente la registrazione di forze piconewton altamente transitorie, che possono essere successivamente “cancellate” dall’aggiunta di acidi nucleici complementari che rimuovono la serratura. Questa capacità di alternare tra la mappatura della tensione in tempo reale e la memorizzazione di informazioni meccaniche rivela forze deboli, di breve durata e meno abbondanti, che sono comunemente impiegate dalle cellule T come parte delle loro funzioni immunitarie.

Introduction

Le cellule immunitarie difendono dagli agenti patogeni e dalle cellule tumorali strisciando e scansionando continuamente le superfici delle cellule bersaglio alla ricerca di antigeni, costellando la loro superficie 1,2. Il riconoscimento dell’antigene viene avviato al momento del legame tra il recettore delle cellule T (TCR) e il complesso di istocompatibilità peptide-maggiore MHC (pMHC) espresso sulla superficie delle cellule bersaglio. Poiché il riconoscimento TCR-pMHC avviene alla giunzione tra due cellule mobili, è stato a lungo sospettato di sperimentare forze meccaniche. Inoltre, questo ha portato al modello meccanosensore di attivazione TCR, che suggerisce che le forze TCR contribuiscono alla sua funzione 3,4. Per capire quando, dove e come le forze meccaniche contribuiscono alla funzione delle cellule T, è imperativo sviluppare strumenti per visualizzare le forze molecolari trasmesse dalle cellule T. Tradizionalmente, metodi come la microscopia della forza di trazione (TFM) e gli array di micropilastri sono usati per studiare le forze cellulari 5,6. Tuttavia, la sensibilità alla forza degli array di TFM e micropilastri è alla scala nanonewton (nN) e quindi è spesso insufficiente per studiare le forze molecolari di piconewton (pN) trasmesse dai recettori cellulari7. Per migliorare la forza e la risoluzione spaziale per il rilevamento, il nostro laboratorio ha aperto la strada allo sviluppo di sonde di tensione molecolare, che sono state inizialmente sintetizzate utilizzando polimeri di polietilenglicole (PEG)7. Le sonde di tensione molecolare sono costituite da una “molla” molecolare estensibile (PEG, proteina, DNA) affiancata da un fluoroforo e un quencher e sono ancorate su una superficie. Le forze applicate al terminale della sonda portano alla sua estensione, separando il fluoroforo e il quencher, e generando così un forte segnale di fluorescenza (Figura 1A)8,9,10.

Negli ultimi dieci anni abbiamo sviluppato una libreria di diverse classi di sonde di tensione molecolari con elementi a molla costituiti da acidi nucleici11, proteine10 e polimeri8. Tra questi, le sonde di tensione basate sul DNA forniscono il più alto rapporto segnale/rumore e la massima sensibilità alla forza, che è facilmente sintonizzata da pochi pN fino a ~20 pN11. Abbiamo utilizzato queste sonde di tensione del DNA in tempo reale per studiare le forze molecolari generate da molti diversi tipi di cellule, tra cui fibroblasti, cellule tumorali, piastrine e cellule immunitarie11,12,13. Questo manoscritto descriverà i protocolli per sintetizzare e assemblare sonde di tensione del DNA su una superficie per mappare le forze dei recettori molecolari con risoluzione della forza pN utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale. Mentre l’attuale procedura include modifiche chimiche all’acido nucleico per introdurre il reporter fluorescente (Figura 1B), è importante notare che molte delle fasi di modifica e purificazione possono essere esternalizzate a società di sintesi del DNA personalizzate. Pertanto, la tecnologia delle sonde di tensione del DNA è facile e accessibile alle più ampie comunità di biologia cellulare e meccanobiologia.

In breve, per assemblare i sensori di tensione del DNA, una forcina di DNA viene ibridata con un filamento di ligando fluorescente su un braccio e un filamento di ancoraggio di quencher sull’altro braccio e quindi immobilizzato su un substrato di vetro (Figura 1C, tensione in tempo reale). In assenza di forza meccanica, la forcina viene chiusa e quindi la fluorescenza viene spenta. Tuttavia, quando la forza meccanica applicata è maggiore di F1/2 (la forza all’equilibrio che porta a una probabilità del 50% di dispiegarsi), la forcina si scioglie meccanicamente e viene generato un segnale fluorescente.

Basandoci sul sensore di tensione del DNA in tempo reale, descriviamo anche i protocolli per mappare le forze accumulate, che è particolarmente utile per studiare le interazioni tra i recettori sulle cellule immunitarie e il loro ligando naturale. Questo perché i recettori immunitari spesso mostrano legami di breve durata 3,14. Le forze accumulate vengono visualizzate utilizzando un filamento di “bloccaggio” che si lega preferenzialmente alle forcine di DNA aperte e consente la memorizzazione di segnali di fluorescenza associati a eventi di trazione meccanica (Figura 1C, tensione bloccata). Il filo di bloccaggio è progettato per legare un sito di legame criptico che viene esposto alla fusione indotta meccanicamente della forcina e bloccare la forcina nello stato aperto bloccando la ripiegatura della forcina, memorizzando così il segnale di tensione e generando una mappa di tensione accumulata. Inoltre, il filo di bloccaggio è progettato con un appiglio a otto nucleotidi, che consente una reazione di spostamento del filamento mediata dalla presa con il suo complemento completo, il filamento “sbloccante”. Con l’aggiunta del trefolo di sblocco, il filo di bloccaggio legato viene rimosso dal costrutto a forcina, cancellando il segnale di tensione memorizzato e ripristinando la forcina allo stato in tempo reale.

Figure 1
Figura 1: Schema delle sonde di tensione molecolari all’avanguardia . (A) Progettazione generale della sonda di tensione molecolare in tempo reale, (B) Filamenti per il costrutto della sonda di tensione basata sul DNA e (C) sonde di tensione basate sul DNA ingegnerizzate e loro commutazione tra stato in tempo reale e stato bloccato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il protocollo principale consiste di quattro sezioni principali: preparazione degli oligonucleotidi, preparazione della superficie, imaging e analisi dei dati. Questo protocollo è stato dimostrato con successo dal nostro laboratorio e da altri in cellule T CD8+ OT-1 naïve e attivate, cellule CD4+ OT-II e ibridomi e può essere applicato per interrogare diversi recettori delle cellule immunitarie tra cui il recettore delle cellule T, il recettore della morte cellulare programmata (PD1) e le forze dell’antigene 1 associato alla funzione linfocitaria (LFA-1). Le cellule T CD8 + naïve OT-1 sono usate come linea cellulare di esempio in questo articolo.

Protocol

I topi transgenici OT-1 sono ospitati presso la Division of Animal Resources Facility della Emory University. Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti nell’ambito del protocollo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Preparazione di oligonucleotidi Sciogliere il DNA del filamento del ligando in acqua (resistività 18,2 MΩ, utilizzata in tutto il protocollo). Vortice e far girare la soluzione con una centrifuga da tavolo. Sintonizzare il volume d’acqua …

Representative Results

Qui mostriamo immagini rappresentative del controllo della qualità della superficie (Figura 4). Una superficie di alta qualità dovrebbe avere uno sfondo pulito nel canale RICM (Figura 4B) e un’intensità di fluorescenza uniforme nel canale Cy3B (Figura 4C). Con le stesse apparecchiature di imaging e identiche condizioni di acquisizione dell’imaging a fluorescenza, l’intensità della fluorescenza di fondo dovrebbe essere coerente e…

Discussion

Con le procedure dettagliate fornite qui, è possibile preparare substrati di sonda di tensione a forcina di DNA per mappare e quantificare la tensione del recettore prodotta dalle cellule immunitarie. Quando le cellule vengono placcate sul substrato della sonda di tensione della forcina del DNA, atterrano, si attaccano e si diffondono mentre i recettori percepiscono i ligandi sia chimicamente che meccanicamente, l’ultimo dei quali viene rilevato dalle nostre sonde. Tuttavia, in alcuni casi le cellule potrebbero non rius…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 e NSF CAREER 1350829. Ringraziamo il NIH Tetramer Facility per i ligandi pMHC. Questo studio è stato supportato, in parte, dall’Emory Comprehensive Glycomics Core.

Materials

 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) Sigma 56197 maldi-TOF-MS matrix
 mPEG-SC Biochempeg MF001023-2K surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Acros AC430941000 surface prep
10x Red blood cell lysis buffer Biolegend 00-4333-57 buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid Nanocomposix customized order surface prep
Atto647N NHS ester Sigma 18373-1MG-F fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy Thermo Fisher Scientific A7816 imaging
BD Syringes only with Luer-Lok BD bioscience 309657 cells
biotinylated anti-mouse CD3e ebioscience 13-0031-82 antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) NIH Tetramer Core Facility at Emory University NA antibody/ligand
bovine serum albumin Sigma 735078001 block non-specific interactions
Cell strainers Biologix 15-1100 cells
Coverslip Mini-Rack, teflon Thermo Fisher Scientific C14784 surface prep
Cy3B NHS ester GE Healthcare PA63101 fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CM buffer
ethanol Sigma 459836 surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS) Sigma H8264 buffer
hydrogen peroxide Sigma H1009 surface prep
LA-PEG-SC Biochempeg HE039023-3.4K surface prep
Midi MACS (LS) startup kit Miltenyi Biotec 130-042-301 cells
mouse CD8+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec 130-104-075 cells
Nanosep MF centrifugal devices Pall laboratory ODM02C35 oligo prep
No. 2 round glass coverslips VWR 48382-085 surface prep
NTA-SAM Dojindo Molecular Technologies N475-10 surface prep
P2 gel Bio-rad 1504118 oligo prep
sufuric acid EMD Millipore Corporation SX1244-6 surface prep
Sulfo-NHS acetate Thermo Fisher Scientific 26777 surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm 653950-702 oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system Thermo Fisher water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective Nikon Microscopy
Cy5 cube CHROMA Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) Photometrics Microscopy
High-performance liquid chromatography Agilent 1100 oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source Nikon Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) Voyager STR oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope Nikon Microscopy
Nikon Perfect Focus System Nikon Microscopy
NIS Elements software Nikon Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube CHROMA Microscopy
RICM cube CHROMA Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm Coherent Microscopy
TRITC cube CHROMA Microscopy
oligo name 5' modification / 3' modification sequence (5' to 3') Use
15mer amine locking strand 5' modification: no modification
3' modification: /3AmMO/
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand 5' modification: Atto647N
3' modification: /3AmMO/
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand 5' modification: no modification
3' modification: no modification
A AAA AAC ATT TAT AC locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand 5' modification: no modification
3' modification: no modification
GTGAAATACCGCACAGATGCGT
TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT
ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC
CAGC
hairpin probe
amine ligand strand 5' modification: /5AmMC6/
3' modification: /3Bio/
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT hairpin probe
BHQ2 anchor strand 5' modification: /5ThiolMC6-D/
3' modification: /3BHQ_2/
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT    hairpin probe
Cy3B ligand strand 5' modification: Cy3B
3' modification: /3Bio/
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT hairpin probe
unlocking strand 5' modification: no modification
3' modification: no modification
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C unlocking accumulated tension signal

Referências

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Citar este artigo
Ma, R., Kellner, A. V., Hu, Y., Deal, B. R., Blanchard, A. T., Salaita, K. DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells. J. Vis. Exp. (169), e62348, doi:10.3791/62348 (2021).

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