Ernte und Disaggregation: Ein übersehener Schritt in der Erforschung von Biofilmmethoden
Summary
Dieses Papier beschreibt Methoden, die drei gängige Biofilmernte- und Disaggregationstechniken auf zwei Oberflächentypen demonstrieren, Robustheitstests einer Erntemethode und Mindestinformationen, die bei der Auswahl und Optimierung von Ernte- und Disaggregationstechniken zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit zu berücksichtigen sind.
Abstract
Biofilmmethoden bestehen aus vier verschiedenen Schritten: Züchtung des Biofilms in einem relevanten Modell, Behandlung des reifen Biofilms, Ernte des Biofilms von der Oberfläche und Disaggregation der Klumpen und Analyse der Probe. Von den vier Schritten sind Ernte und Disaggregation die am wenigsten untersuchten, aber dennoch kritisch, wenn man das Potenzial für Testverzerrungen berücksichtigt. Dieser Artikel demonstriert häufig verwendete Ernte- und Disaggregationstechniken für Biofilme, die auf drei verschiedenen Oberflächen gezüchtet werden. Die drei Biofilmernte- und Disaggregationstechniken, die aus einer umfangreichen Literaturrecherche stammen, umfassen Vortexing und Beschallung, Scraping und Homogenisierung sowie Scraping, Vortexing und Beschallung. Es werden zwei Oberflächentypen berücksichtigt: hartes, nicht poröses (Polycarbonat und Borosilikatglas) und poröses (Silikon). Darüber hinaus geben wir Empfehlungen für die Mindestinformationen, die bei der Berichterstattung über die befolgte Erntetechnik enthalten sein sollten, sowie eine begleitende Methode zur Überprüfung auf Verzerrungen.
Introduction
Die Definition von Biofilm hat sich in den letzten Jahrzehnten weiterentwickelt und umfasst die mikrobielle Assoziation mit einer Vielzahl von biologischen und/oder nicht-biologischen Oberflächen, einschließlich nichtzellulärer Komponenten1, die ein unterschiedliches Wachstum und eine unterschiedliche genetische Expression2 innerhalb einer Matrix aufweisen. Biofilm bietet Schutz vor Umweltbelastungen wie Trocknung und kann die Wirkung chemischer Desinfektionsmittel weniger wirksam machen, was zum Überleben von Mikroben führt. Die Überlebenden in einem Biofilm können möglicherweise eine Quelle für pathogene Mikroorganismen darstellen, die ein Problem für die öffentliche Gesundheit darstellen3.
Biofilmmethoden bestehen aus vier Schritten: Wachstum, Behandlung, Probenahme (Ernte und Disaggregation) und Analyse. Das Wachstum, der erste Schritt, bei dem der Benutzer die Wachstumsbedingungen, die Temperatur, die Medien usw. des Organismus bestimmt, wird in der Biofilmliteratur am meisten berücksichtigt und berichtet4,5,6,7. Der Behandlungsschritt bewertet antimikrobielle Mittel (z. B. Desinfektionsmittel), um ihre Wirksamkeit entweder gegen einen reifen Biofilm3,8,9 zu bestimmen, oder das antimikrobielle Mittel kann in die Oberfläche eingearbeitet werden, um die Fähigkeit des Produkts zu bestimmen, das Wachstum von Biofilmen zu verhindern oder zu reduzieren10. Der dritte Schritt, die Probenahme, umfasst Schritte zur Ernte des Biofilms von der Oberfläche, auf der er wuchs, und zur Disaggregation der entfernten Klumpen3,8,11. Der vierte Schritt, die Analyse, kann lebensfähige Zellzahlen, Mikroskopie, Fluoreszenzmessungen, molekulare Ergebnisse und/oder eine Matrixkomponentenbewertung umfassen8,9. Die Auswertung der Daten gibt Aufschluss über das Ergebnis eines Experiments. Von den vier ist die Probenahme oft der am meisten übersehene Schritt, da davon ausgegangen wird, dass die gewählte Biofilmernte- und / oder Disaggregationstechnik zu 100% wirksam ist, oft ohne Überprüfung11.
Planktonische Suspensionen von Bakterien, die oft als homogen angesehen werden, erfordern vor der Analyse eine einfache Wirbelung. Biofilme sind jedoch komplexe Gemeinschaften, die aus Mikroorganismen (prokaryotisch und/oder eukaryotisch), Exopolysacchariden, Proteinen, Lipiden, extrazellulärer DNA und Wirtszellen bestehen12. Schritte über traditionelle planktonische mikrobiologische Kulturmethoden hinaus sind erforderlich, um Biofilm von einer Oberfläche adäquat zu ernten und dann in eine homogene Einzelzellsuspension zu disaggregieren. Eine umfangreiche Literaturrecherche (Informationen, die nicht in dieser Veröffentlichung enthalten sind) zeigte, dass die Wahl der Entfernungs- und Disaggregationstechnik von einer Reihe von Faktoren abhängt, einschließlich der im Biofilm vorhandenen Arten, der Oberfläche, an der der Biofilm befestigt ist (nicht porös oder porös), der Zugänglichkeit zu Wachstumsoberflächen (leicht entfernbarer Gutschein oder physische Zerstörung der Vorrichtung, in der der Biofilm wächst), Oberflächengeometrie (Fläche und Form), Dichte des Biofilms auf Wachstumsflächen und verfügbare Laborgeräte.
Wenn Biofilm von einer Oberfläche geerntet wird, ist die resultierende Zellsuspension heterogen. Soll diese ungleichmäßige Suspension genau aufgezählt werden, muss sie in einzelne Zellen disaggregiert werden. Lebensfähige Plattenzählungen gehen davon aus, dass eine koloniebildende Einheit aus einem Bakterium stammt. Wenn Aggregate von Biofilm auf dem Wachstumsmedium platziert werden, ist es unmöglich, einzelne Zellen zu unterscheiden, was zu ungenauen Schätzungen führen könnte. Wenn beispielsweise während der desinfizierenden Wirksamkeitsprüfung der Behandlung der Biofilm im Vergleich zur Kontrolle sehr effektiv von einer Oberfläche entfernt wird, könnte die logarithmische Reduktion im Vergleich zur Kontrolle künstlich groß erscheinen. Auf der anderen Seite scheint ein chemisches Desinfektionsmittel, das Biofilm auf einer Oberfläche fixiert, im Vergleich zur Kontrolle eine geringere Log-Reduktion zu haben11. Diese Art von Szenario könnte zu einer verzerrten Interpretation experimenteller Daten führen.
In Vorbereitung auf die Veröffentlichung wurde in einer Literaturübersicht festgestellt, dass gängige Ansätze zur Ernte und Disaggregation von Biofilmen Scraping, Swabbing, Beschallung, Vortexing oder eine Kombination davon umfassen. Scraping ist definiert als die physikalische Entfernung von Biofilm von Oberflächen mit einem sterilen Stab, Spatel oder einem anderen Werkzeug. Tupfen bezieht sich auf das Entfernen von Biofilm von Oberflächen mit einem Baumwollstab oder einem anderen festen saugfähigen Material. Beschallung bezieht sich auf die Störung des Biofilms von Oberflächen durch Ultraschallwellen, die durch Wasser verteilt werden. Vortexing bezieht sich auf die Verwendung eines Mischers, um einen flüssigen Wirbel der Probe in einem Rohr zu erreichen. Bei der Homogenisierung werden rotierende Schaufeln verwendet, um geerntete Biofilmklumpen in eine Einzelzellsuspension zu scheren. In diesem Artikel stellen wir drei Ernte- und Disaggregationsmethoden für zwei verschiedene Oberflächentypen vor, hart/porös und porös.
Eine Liste der empfohlenen Mindestinformationen, die Forscher in die Methodenabschnitte von Publikationen aufnehmen sollten, wird bereitgestellt. Wir hoffen, dass die Einbeziehung dieser Informationen es anderen Forschern ermöglicht, ihre Arbeit zu reproduzieren. Es gibt keine perfekte Ernte- und Disaggregationsmethode, daher werden auch Empfehlungen zur Überprüfung der Technik gegeben.
Drei gängige Methoden zur Ernte und Disaggregation von Biofilmen von gemeinsamen Wachstumsoberflächen werden in diesem Artikel demonstriert. Diese Informationen werden es den Forschern ermöglichen, die Gesamtpräzision und -verzerrung einer Biofilmtestmethode besser zu verstehen. Die beschriebenen Methoden sind wie folgt: (1) Ein Pseudomonas aeruginosa-Biofilm , der auf Polycarbonat-Kupons (harte, nicht poröse Oberfläche) unter hoher Flüssigkeitsscherung im CDC-Biofilmreaktor gezüchtet wird, wird nach einer fünfstufigen Kombination von Vortexing und Beschallung geerntet und disaggregiert, um Biofilmernte und -disaggregation zu erreichen (2) A P. aeruginosa Biofilm, der auf Borosilikatglas-Coupons (harte, nicht poröse Oberfläche) im Tropfstromreaktor unter geringer Flüssigkeitsscherung gezüchtet wird, wird durch Schaben und Homogenisierung geerntet und disaggregiert (3) Ein Escherichia coli-Biofilm , der in Silikonschläuchen (poröse Oberfläche) gezüchtet wird, wird geerntet und durch Schaben disaggregiert, gefolgt von Beschallung und Vortexing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mindestinformationen für Ernte- und Disaggregationsmethoden
Um reproduzierbare Biofilmdaten in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft zu erstellen, ist es unerlässlich, dass die Autoren so viele Details wie möglich über jeden der Wachstums-, Behandlungs-, Probenahme- und Analyseschritte einer Biofilmmethode angeben. Die Standardisierung von Biofilmmethoden hat bei diesem Bestreben geholfen, da sie es dem Forscher ermöglicht, auf eine bestimmte Methode und alle relevanten Modifikationen zu v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers und Fei San Lee für ihre Beiträge zu diesem Papier danken.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Referências
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