Este artigo detalha métodos que demonstram três técnicas comuns de coleta e desagregação de biofilmes em dois tipos de superfície, testes de robustez de um método de colheita e informações mínimas a serem consideradas ao escolher e otimizar técnicas de colheita e desagregação para aumentar a reprodutibilidade.
Artigo de método
Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os métodos de biofilme consistem em quatro etapas distintas: o crescimento do biofilme em um modelo relevante, o tratamento do biofilme maduro, a colheita do biofilme da superfície e a desagregação dos aglomerados e a análise da amostra. Das quatro etapas, a colheita e a desagregação são as menos estudadas, mas ainda assim críticas quando se considera o potencial de viés de teste. Este artigo demonstra técnicas de colheita e desagregação comumente utilizadas para biofilme cultivado em três superfícies diferentes. As três técnicas de coleta e desagregação de biofilmes, obtidas a partir de uma extensa revisão da literatura, incluem vórtice e sônica, raspagem e homogeneização, raspagem, vórtice e sônicação. Dois tipos de superfície são considerados: duro não poroso (policarbonato e vidro borossilicato) e poroso (silicone). Além disso, fornecemos recomendações para as informações mínimas que devem ser incluídas ao relatar a técnica de colheita seguida e um método de acompanhamento para verificar o viés.
Introdução
A definição de biofilme evoluiu ao longo das últimas décadas e engloba a associação microbiana com uma variedade de superfícies biológicas e/ou não biológicas, inclusão de componentes nãocelulares1 que apresentam crescimento diferente e expressão genética2 dentro de uma matriz. O biofilme fornece proteção contra estresses ambientais, como a secagem, pode tornar a ação de desinfetantes químicos menos eficaz, resultando na sobrevivência de micróbios. Os sobreviventes dentro de um biofilme podem potencialmente fornecer uma fonte de microrganismos patogênicos que são uma preocupação de saúde pública3.
Os métodos de biofilme são compostos por quatro etapas, crescimento, tratamento, amostragem (colheita e desagregação) e análise. O crescimento, o primeiro passo, onde o usuário determina as condições de crescimento do organismo, temperatura, mídia, etc., é o mais considerado e relatado na literatura de biofilme4,5,6,7. A etapa de tratamento avalia os antimicrobianos (por exemplo, desinfetantes) para determinar sua eficácia, seja contra um biofilme maduro3,8,9 ou o antimicrobiano pode ser incorporado à superfície para determinar a capacidade do produto de prevenir ou reduzir o crescimento do biofilme10. O terceiro passo, amostragem, inclui etapas para colher o biofilme da superfície em que estava crescendo e desagregar os aglomerados removidos3,8,11. A quarta etapa, análise, pode incluir contagem de células viáveis, microscopia, medidas de fluorescência, desfechos moleculares e/ou uma avaliação de componentes matricia8,9. A avaliação dos dados fornece informações sobre o resultado de um experimento. Dos quatro, a amostragem é muitas vezes o passo mais negligenciado porque presume que a técnica de colheita de biofilme e/ou desagregação escolhida é 100% eficaz, muitas vezes sem verificação11.
Suspensões planctônicas de bactérias, muitas vezes consideradas homogêneas, requerem vórtice simples antes da análise. Os biofilmes, no entanto, são comunidades complexas compostas por microrganismos (procarióticos e/ou eucarióticos), exopolysacarídeos, proteínas, lipídios, DNA extracelular e células hospedeiras12. Passos além dos métodos tradicionais de cultura microbiológica planctônica são necessários para colher adequadamente o biofilme de uma superfície e, em seguida, desagregá-lo em uma suspensão celular única homogênea. Uma extensa revisão da literatura (informações não incluídas nesta publicação) demonstrou que a escolha da técnica de remoção e desagregação depende de uma série de fatores, incluindo espécies presentes no biofilme, superfície a que o biofilme está ligado (não poroso ou poroso), acessibilidade a superfícies de crescimento (cupom facilmente removível ou destruição física de aparelhos nos quais o biofilme está crescendo), geometria da superfície (área e forma), densidade de biofilme em superfícies de crescimento e equipamentos de laboratório disponíveis.
Quando o biofilme é colhido de uma superfície, a suspensão celular resultante é heterogênea. Se essa suspensão não uniforme for enumerada com precisão, ela deve ser desagregada em células individuais. As placas viáveis assumem que uma unidade formadora de colônias se origina de uma bactéria. Se os agregados de biofilme forem colocados no meio de crescimento, é impossível distinguir células individuais que poderiam levar a estimativas imprecisas. Por exemplo, durante o teste de eficácia desinfetante, se um tratamento remover o biofilme de forma muito eficaz de uma superfície em comparação com o controle, a redução do tronco pode parecer artificialmente grande em comparação com o controle. Por outro lado, um desinfetante químico que fixa biofilme em uma superfície em comparação com o controle parecerá ter uma redução menor do tronco11. Esse tipo de cenário pode levar a uma interpretação tendenciosa dos dados experimentais.
Em preparação para a publicação, uma revisão da literatura determinou que abordagens comuns à colheita e desagregação do biofilme incluem raspagem, swabbing, sonicação, vórtice ou uma combinação destes. A raspagem é definida como remoção física de biofilme de superfícies com uma vara estéril, espátula ou outra ferramenta. Swabbing refere-se à remoção de biofilme de superfícies com uma vara de ponta de algodão ou outro material absorvente fixo. A sônica refere-se à interrupção do biofilme das superfícies através de ondas ultrassônicas distribuídas através da água. Vortexing refere-se ao uso de uma batedeira para alcançar um vórtice líquido da amostra dentro de um tubo. A homogeneização utiliza lâminas rotativas para tesourar aglomerados de biofilme colhidos em uma única suspensão celular. Neste artigo, apresentamos três métodos de colheita e desagregação para dois tipos de superfície diferentes, duros/não porosos e porosos.
Uma lista de informações mínimas recomendadas que os pesquisadores devem incluir nos métodos seções de publicações é fornecida. Esperamos que a inclusão dessas informações permita que outros pesquisadores reproduzam seu trabalho. Não há um método perfeito de colheita e desagregação, portanto, recomendações de como verificar a técnica também são fornecidas.
Três métodos comuns para colher e desagregar biofilme de superfícies comuns de crescimento são demonstrados neste artigo. Essas informações permitirão aos pesquisadores entender melhor a precisão e o viés geral de um método de teste de biofilme. Os métodos descritos são os seguintes: (1) Um biofilme pseudomonas aeruginosa cultivado em cupons de policarbonato (superfície não porosa dura) sob cisalhamento de fluidos elevados no Reator de Biofilme CDC é colhido e desagregado após uma combinação de cinco passos de vórtice e sonicação para alcançar a colheita de biofilme e desagregação (2) A Aeruginosa biofilme cultivado em cupons de vidro borossilicato (superfície não porosa dura) no reator de fluxo de gotejamento sob cisalhamento de baixo fluido é colhido e desagregado usando raspagem e homogeneização (3) Um biofilme Escherichia coli cultivado em tubos de silicone (superfície porosa) é colhido e desagregadoreg usando raspagem, seguido de sonicação e vórtice.
Protocolo
1. Vórtice e sônica
- Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro de 15442 cultivado de acordo com o ASTM Standard E25622.
- Ao final do período de crescimento de 48 horas, prepare-se para tratar os cupons de biofilme e amostra de acordo com o ASTM Standard E28718
- Asepticamente insira protetores de respingo autoclaved em tubos cônicos estéreis de 50 mL usando fórceps esterilizados por chamas. Repita para todos os tubos que receberão tratamento. Tubos para cupons de controle não precisam de um protetor de respingo.
- Remova asepticamente uma haste selecionada aleatoriamente do Reator de Biofilme CDC. Enxágüe cupons para remover células frouxamente anexadas mergulhando suavemente a haste em 30 mL de água tampão estéril.
- Segure a haste paralela à parte superior do banco, sobre um tubo cônico vazio e estéril de 50 mL e usando uma chave Allen esterilizada por chamas, solte o parafuso definido para soltar um cupom revestido de biofilme no tubo. Repita para o número desejado de cupons. Remova os protetores de respingo e coloque em um recipiente separado para esterilização.
- Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, pipeta lentamente 4 mL do tratamento ou controle nos tubos para que o líquido flua pelo interior da parede do tubo.
- Toque suavemente na parte inferior do tubo para que quaisquer bolhas de ar sob o cupom sejam deslocadas. Permitir 30 - 60 s entre cada adição.
- Ao final do tempo de contato especificado, pipeta 36 mL de neutralizador nos tubos na mesma ordem que o tratamento (ou controle) foi aplicado.
NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm. - Vórtice cada tubo na configuração mais alta para 30 ± 5 s. Certifique-se de que um vórtice completo seja alcançado.
NOTA: Deve-se ter cuidado ao emitir cupons pesados, como aço inoxidável em frascos de vidro onde possa ocorrer quebra. - Determine o número ideal de tubos por banho e colocação dentro do rack do tubo de ensaio antes de processar amostras reais. Se processar várias amostras, confirme que a temperatura da água no banho sonicating é de 21 ± 2 oC.
- Coloque tubos no rack de tubo suspensos no sonicator desgassed de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido em tubos. Sonicate a 45 kHz, 100% de potência e função Normal para 30 ± 5 s. Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final (5 ciclos no total).
NOTA: Estes tubos com o biofilme colhido e desagregado são a diluição 100 ou 0. - Amostra diluída em série em água tamponada. Placa no ágar R2A usando método de revestimento apropriado. Incubar a 36 ± 2 oC por 24 h. Conte colônias conforme apropriado para o método de chapeamento usado e dados de registro.
2. Raspagem e homogeneização
- Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro ATCC 15442 de acordo com o ASTM Standard E264713.
- Configure a estação de amostragem para incluir placa de amostragem, 95% de etanol em um béquer, queimador de álcool, hemostats, ferramenta de remoção de cupom, béquers com água de diluição estéril e tubos de diluição para enxaguar os cupons.
- Desligue a bomba. Remova uma tampa de canal e use uma ferramenta de remoção de cupom estéril e hemostats para remover o cupom, tomando cuidado para não perturbar o biofilme.
- Enxágüe o cupom imergindo suavemente, com um movimento fluido, em 45 mL de água de diluição estéril (contida em um tubo de centrífuga de 50 mL). Inverta imediatamente o movimento para remover o cupom.
- Coloque o cupom em um béquer contendo 45 mL de água de diluição estéril. Raspe a superfície do cupom coberto de biofilme em uma direção descendente por aproximadamente 15 s, usando uma espátula estéril ou raspador. Enxágüe a espátula ou raspadora mexendo-a no béquer. Repita o processo de raspagem e lavagem 3-4 vezes, garantindo a cobertura completa da superfície do cupom.
- Enxágüe o cupom segurando-o em um ângulo de 60° sobre o béquer estéril e tubos de 1 mL de água de diluição estéril sobre a superfície do cupom. Repita para um total de 5 enxágues. O volume final no béquer é de 50 mL.
NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm. - Substitua cada tampa do canal à medida que os cupons forem removidos.
- Trabalhando no armário de biossegurança, homogeneize a amostra de biofilme raspada. Conecte uma sonda homogeneizadora estéril ao homogeneizador, coloque a ponta da sonda no líquido, ligue o homogeneizador e aumente até 20.500 rpm.
- Homogeneize a amostra para 30 s. Abaixe os RPMs e desligue o homogeneizador.
- Higienize a sonda entre amostras de biofilme homogeneizando um 9 mL de diluição estéril em branco a 20.500 rpm por 30 s como descrito acima. Homogeneize um tubo de 9 mL de 70% de etanol para 30 s, desprende a sonda e deixe ficar no tubo de etanol por 1 min. Homogeneize dois espaços adicionais de diluição.
NOTA: Pode ser utilizado um teste homogeneizador descartável para cada amostra. - Diluir as amostras em água tamponada. Placa no ágar R2A usando o método de revestimento apropriado. Incubar placas a 36 ± 2oC por 24 h, contar colônias conforme apropriado ao método de chapeamento utilizado e registrar dados.
3. Raspagem, vórtice e sônica
- Cresça um biofilme Escherichia coli maduro ATCC 53498 em tubos de cateter de silicone10.
- Prepare materiais de amostragem: tubos de lavagem, tubo de centrífugas estéril, placa de Petri estéril vazia, hemostato de aço inoxidável esterilizado e tesoura, temporizador e régua.
- Com a bomba pausada, use 70% de etanol para limpar a parte externa da tubulação. Meça 2 cm a partir da extremidade, evitando a área anexada ao conector, e marque a tubulação para determinar os locais de corte.
- Com a tesoura esterilizada da chama, corte o tubo na marca de 2 cm e coloque o segmento em placa de Petri estéril vazia. Limpe a tubulação com 70% de etanol e reconecte a extremidade distal ao tubo de resíduo.
- Enxágüe o segmento de tubos para remover células planctônicas. Com fórceps esterilizados pela chama, mergulhe suavemente o segmento de tubos em 20 mL de água de diluição estéril e, em seguida, remova imediatamente. Coloque o segmento em 10 mL de neutralizador.
- Com fórceps esterilizados de chama, segure o segmento de tubulação e raspe com vara de aplicador de madeira estéril até que todas as áreas internas do tubo tenham sido raspadas. Ocasionalmente enxágue a vara nos 10 mL de neutralizador e coloque o segmento de volta no tubo de amostra. O segmento de tubulação raspada é a diluição de 100 ou 0.
NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm. - Vórtice cada tubo na configuração mais alta para 30 ± 5 s. Coloque o tubo no rack de tubo suspenso no sonicator de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido nos tubos. Sonicate a 45 kHz, 100% de potência e função Normal por 30 ± 5 segundos. Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final.
NOTA: Este tubo com o biofilme colhido e desagregado é a diluição de 100 . - Diluir as amostras em água tamponada. Placa no Tryptic Soy Agar usando o método de revestimento apropriado.
- Incubar placas a 36 ± 2 oC por 24 h. Conde colônias conforme apropriado para o método de chapeamento usado, registrar dados e calcular a média aritmética.
Resultados
Validação/Confirmação de um Método de Colheita
Vários estudos realizados em nosso laboratório examinaram a capacidade de vórtice e sônica para colher efetivamente o biofilme cultivado no reator biofilme (ASTM E2562)2 utilizando o Método Único do Tubo (ASTM E2871)8.
Um biofilme P. aeruginosa ATCC 15442 foi cultivado de acordo com aSTM E25622 em cupons de vidro borossilicato. Após 48 horas, quatro cupons foram colocados em frascos, "tratados" com água tampão estéril de 4 mL e neutralizados com 36 mL de caldo neutralizante 2x D/E. A configuração inicial de sônicação de 45 kHz, 10% de potência, configuração Sweep, 30 ± 5 s foi usada para colher e desagregar o biofilme de três dos quatro cupons. Após a conclusão do vórtice e do ciclo de sônica, cada cupom foi manchado com violeta cristalina e fotografado. A Figura 1 demonstra a quantidade de biofilme restante nos três cupons após o vórtice e a sonicação em comparação com o controle.
Para testar isso ainda mais, um biofilme P. aeruginosa ATCC 15442 foi cultivado como descrito anteriormente e duas configurações de sônica foram comparadas: 1) 45 kHz, 10% de potência, configuração de varredura, 30 ± 5 segundos e 2) 45 kHz, 100% de potência, configuração normal, 30 ± 5 segundos. Um cupom de cada conjunto dos três foi manchado com mancha BacLight Live/Dead e imageado usando microscopia confocal (CM). Os dois cupons restantes de cada conjunto foram diluídos, banhados e enumerados para células viáveis. Os resultados da contagem de placas viáveis foram 9.230 Log10 CFU/cupom ± 0,007 (SD_R) para a configuração 1 e 9.272 Log10 CFU/cupom ± 0,066 (SD_R) para a configuração de sônica 2. Esses dados corroboraram um Estudo Colaborativo do Método Único de Tubo da EPA de 2015, onde 9,03 Log10 CFU/cupom ± 0,272 (SD_R) foi alcançado9. De acordo com a contagem de placas viáveis, parece que todos os três meios são semelhantes o suficiente para não justificar uma investigação mais aprofundada sobre as diferenças entre os dois métodos de colheita. No entanto, as imagens microscópicas mostradas na Figura 2 podem sugerir que mais biofilmes permaneceram após o uso da configuração 1 do que a configuração 2. Enquanto observamos que o biofilme restante nos cupons parece morto (vermelho na cor), a interpretação da viabilidade ao usar a mancha BacLight Live/Dead é difícil14,15. Em vez de focar nas implicações de viabilidade do biofilme manchado, usamos essa mancha para visualizar o biofilme permanecendo nas superfícies. Além disso, embora reconheçamos que a sônicação pode ser deletério à viabilidade bacteriana, uma publicação de 2007 de Kobayashi et al.16 demonstrou que o aumento do tempo de sonicação além de 5 minues resultou em diminuição da contagem de placas viáveis. Como nosso estudo usou um total de 1 minuto de sônica, estamos confiantes de que poucas células foram mortas por sônica, como mostrado pelo >9.2 LOG10 CFU/cupons para os dois parâmetros de sônicação. É interessante que uma colheita completa do biofilme da superfície não tenha sido alcançada por nenhum dos métodos. Este achado demonstra que a contagem de placas viáveis por si só não são adequadas para determinar o viés de colheita e desagregação e, portanto, devem ser emparelhadas com um método adicional, a microscopia, por exemplo.
Além das configurações do sonicator, investigamos outros fatores importantes que afetam a sônicação. Estes incluíam o volume de líquido nos frascos (10 ou 40 mL), o tipo de líquido no frasco (água tamponada ou caldo neutralizante 2X D/E) e o número de frascos colocados no banho ao mesmo tempo (3 ou 12 frascos)9.
Os biofilmes P. aeruginosa nos cupons do Reator biofilm do CDC foram sônicos usando a configuração sonicator 2 (45 kHz, 100% de potência, configuração normal, 30 ± 5 segundos). Todas as amostras foram vórtices 3 de cada vez ou 6 de cada vez usando um vórtice equipado com um acessório de tubo de 6 lugares e depois sisônicos como descrito na Figura 3. Um cupom de cada uma das categorias a seguir foi imageado utilizando CM (Figura 3).
No segundo estudo em que foram investigados parâmetros de sônicação, as imagens microscópicas (Figura 3) sugerem que minimizar o volume nos tubos, reduzir o número de tubos processados de uma só vez e o uso de Caldo Neutralizante D/E (que contém surfactante) contribuem para a melhor colheita de biofilme dos cupons.
Os biocidas podem melhorar positiva ou negativamente a colheita e a desagregação. Semelhante a confirmar que um neutralizador efetivamente para o ativo enquanto não aumenta a morte antes de realizar um teste de eficácia, é importante confirmar que um biocida não afeta diferencialmente a colheita e a desagregação. Para testes de eficácia, o viés resulta se e somente se houver remoção diferencial para o controle versus amostras de biofilme tratado11.
Figura 1: Fotos de cupons manchados com violeta cristalina demonstrando biofilme residual. A) Cupom removido do reator e manchado com violeta cristalina. B, C, D) Três cupons de réplica foram separadamente "tratados" com água tamponada estéril e neutralizada. Para colher e desagregar, os cupons foram vórtices (30 ± 5 segundos) e sonicados (45 kHz, 10% de potência, configuração de varredura, 30 ± 5 segundos) duas vezes e receberam um vórtice final. Imagens cortesia de Danielle Orr e Blaine Fritz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de microscopia confocal de cupons comparando duas configurações de sônica diferentes. Cupons (ampliação de 12,5X) processados através da configuração de sônica 1 (45 kHz, 10% de potência, configuração de varredura) na configuração esquerda ou sônica 2 (45 kHz, 100% de potência, configuração normal) à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens de microscopia confocal de cupons comparando volumes, líquido de sônica e número de tubos. Cupons (ampliação de 12,5X) processados em volumes de 10 ou 40 mL, em água de diluição (DW) ou Caldo neutralizante D/E (D/E), 3 ou 12 tubos de cada vez com configuração de sônica otimizada (45 kHz, 100% de potência, configuração normal). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo complementar 1: Principais parâmetros de importância para a colheita e desagregação Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.
Discussão
Informações mínimas para métodos de colheita e desagregação
Para criar dados reprodutíveis de biofilme em toda a comunidade científica, é imprescindível que os autores incluam o máximo de detalhes possível em relação a cada uma das etapas de crescimento, tratamento, amostragem e análise de um método de biofilme. A padronização dos métodos de biofilme tem auxiliado nesse esforço, pois permite ao pesquisador referenciar um método específico e quaisquer modificações relevantes. No entanto, muitos artigos incluem apenas uma ou duas frases para descrever a colheita e a desagregação de biofilmes. Para melhor reprodutibilidade, recomendamos que informações mínimas para a colheita de biofilmes sejam incluídas nas publicações. Isso se baseia na iniciativa Informações Mínimas Sobre um Experimento de Biofilme (MIABiE) apresentada por Lourenco et al.17. No caso do uso da sônica para a colheita de biofilmes e parâmetros de desagregação, as informações devem incluir: posição dos tubos dentro do banho (recomendações dos fabricantes para evitar danificar os transdutores), número de tubos sônicos ao mesmo tempo, material do tubo, volume e tipo de líquido no tubo, presença de surfactante, posição de líquido em tubos relativos ao nível líquido de banho ultrassônico, dispositivo usado para segurar os tubos no banho (copos de vidro vs. rack de tubo de ensaio), desgaseamento do banho de água antes da sônicação de amostras (se a desgassagem não é uma opção do fabricante, o funcionamento simples do banho antes de inserir as amostras ajudará a remover alguns gases dissolvidos do líquido do banho), temperatura do banho de água (as temperaturas podem subir após longos períodos de sonicação), frequência (25 kHz ou 45 kHz, por exemplo), função de banho (varrer ou normal, por exemplo) e faixa de energia entregue aos transdutores (10 - 100%, por exemplo). Essas configurações devem ser otimizadas para o biofilme que está sendo estudado, o sistema utilizado para o cultivo do biofilme e a marca/modelo específico do banho ultrassônico18.
As configurações do sonicator podem ser alteradas para otimizar os efeitos de colheita desejados. A desgaseamento remove o ar dissolvido dentro do líquido do banho, aumentando assim o poder de limpeza. A frequência pode ser ajustada a um ajuste baixo ou alto. Uma configuração baixa, como 25 kHz, por exemplo, ajudaria na colheita de amostras tenazes, enquanto uma configuração mais elevada de 45 kHz seria mais apropriada para amostras sensíveis. Uma função de banho de varredura ou normal permite a distribuição da cavitação. A função de varredura cria uma mudança contínua da máxima de pressão sonora. A função normal permite que os transdutores operem no modo de meia onda dupla, o que pode resultar em zonas mortas, tornando a sônica menos eficaz. As faixas de potência podem ser alteradas de 10 a 100% da energia entregue aos transdutores19. Sabe-se que a sônica pode afetar prejudicialmente a viabilidade bacteriana. Um estudo de 2008 de Stamper et al.20 expôs culturas bacterianas ao aumento da energia ultrasona ao longo do tempo para criar curvas de morte bacteriana. Recomendamos que os usuários confirmem que uma combinação específica de configurações de sônica não causa uma diminuição em bactérias viáveis20.
Não há um método perfeito para colher e desagregar biofilme, mas métodos particulares funcionam melhor para algumas combinações de superfícies/micróbios do que outros. Defendemos que o leitor determine quais parâmetros são importantes para seu cenário de biofilme particular. Os principais parâmetros de importância para a colheita e desagregação estão incluídos no Arquivo Suplementar 1.
Para os estudos de sônicação feitos para avaliar o viés de colheita e desagregação, descobrimos que a sônica é conveniente, eficiente e capaz de ser padronizada para a colheita e desagregação de biofilme de superfícies. A colocação de cupons em frascos minimiza a variabilidade técnica que seria encontrada em métodos onde os cupons são raspados fisicamente por pessoal de laboratório, por exemplo. Embora pareça simples o suficiente para colocar frascos em um banho de água sônico, existem muitos parâmetros que precisam ser considerados para alcançar a colheita ideal de biofilme.
Dois tipos de equipamentos de sônica estão disponíveis, banhos ultrassônicos e sondas ultrassônicas. Este artigo se concentra principalmente em banhos ultrassônicos onde a energia ultrassônica é gerada na faixa de alta (20 - 45 kHz) a frequência normal (40 - 60 Hz).
Três processos principais estão em jogo ao usar um dispositivo ultrassônico para limpar uma superfície. A energia elétrica é convertida em energia acústica quando uma corrente de alta frequência é enviada para um transdutor piezoelétrico ou magnetostrictivo que oscila em resposta à corrente. A oscilação gera ondas de compressão (rarefação) no líquido. Bolhas de cavitação se formam devido à pressão negativa durante a rarefação. As bolhas crescem até atingirem um tamanho instável e colapsam, criando um jato de água que limpa superfícies21.
Três abordagens de colheita e desagregação são demonstradas neste artigo: métodos de sônicação e vórtice para colheita e desagregação de biofilme quando cultivados em cupons de policarbonato no Reator de Biofilme CDC de acordo com o Método Único do Tubo. Métodos de raspagem e homogeneização para colheita e desagregação de biofilme são mostrados quando cultivados em cupons de vidro usando o Reator de Biofilme de Fluxo de Gotejamento. Métodos de raspagem, sônica e vórtice para colheita e desagregação de biofilme são mostrados quando cultivados em tubos de silicone.
Não existe um método perfeito para colher e desagregar o biofilme, mas algumas abordagens são melhores para diferentes superfícies e/ou aplicações. O importante é aproveitar o tempo para validar o método utilizado. Neste artigo, discutimos o uso de violeta cristalina e microscopia, mas outras opções existem dependendo da sensibilidade necessária. Se a pesquisa inclui testes de eficácia, então é fundamental confirmar a validade da abordagem na presença do antimicrobiano6. Todos os equipamentos são ligeiramente diferentes, por isso, mesmo que o método de colheita e desagregação tenha sido padronizado, ainda é prudente confirmar o processo para os equipamentos utilizados. Os métodos de colheita e desagregação são específicos para bactérias associadas à superfície e biofilme. Pesquisas demonstraram que escolhas inadequadas podem levar a resultados de testes tendenciosos. No entanto, a colheita e a desagregação são as menos estudadas das quatro etapas nos métodos de biofilme. É geralmente também a etapa não validada (dada como certa como trabalho) com a menor informação presente em artigo publicado tornando desafiador reproduzir o processo em um laboratório diferente. Este artigo e vídeo que acompanha mostram três abordagens comuns para dois tipos de superfície e sugere como validar um método para um laboratório individual. Essas informações ajudarão os pesquisadores a tomar decisões mais informadas sobre qual método usar e fornecem orientações sobre o que relatar para melhorar a reprodutibilidade.
Divulgações
Os autores não têm revelações.
Agradecimentos
Queremos reconhecer Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers e Fei San Lee por suas contribuições para este artigo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frascos cônicos de 50 mL | Thermo Scientific | 339652 | |
| copos de vidro de 100 mL | Fisher Scientific | FB102100 | |
| pipetas sorológicas de 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | Para adicionar tratamento a frascos contendo cupons. |
| Pipetas sorológicas de 50 mL | Fisher Scientific | 13-678-14C | Para adicionar neutralizador aos frascos no final do tempo de contato do tratamento. |
| Bastões aplicadores | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Espátula metálica | Fisher Scientific | 14-373 | |
| Policiais em PTFE | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Ferramenta de dispersão | IKA | 4446700 | Para homogeneização de amostras de biofilme. |
| Tesoura | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Cateter de Foley de silicone, tamanho 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Tubo de silicone, tamanho 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Protetores contra respingos BioSurface | Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 Dispersor básico ULTRA-TURRAX | IKA | 3737001 | Para homogeneização de amostras de biofilme. |
| Conectores de tubulação | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Limpador Ultrassônico | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Suporte de Tubo Vertical de 50 mL | Scientific Industries | SI-V506 |
Referências
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- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
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Reimpressões e permissões
