수확 및 분해 : 생물막 방법 연구에서 간과 된 단계
Summary
이 논문에서는 두 가지 표면 유형에서 세 가지 일반적인 생물막 수확 및 분해 기술, 수확 방법의 견고성 테스트 및 재현성을 높이기 위해 수확 및 분해 기술을 선택하고 최적화 할 때 고려해야 할 최소 정보를 시연하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
생물막 방법은 네 가지 별개의 단계로 구성됩니다: 관련 모델에서 생물막을 성장시키고, 성숙한 생물막을 처리하고, 표면으로부터 생물막을 수확하고, 덩어리를 분해하고, 샘플을 분석한다. 네 단계 중 수확과 분해는 가장 적게 연구되었지만 그럼에도 불구하고 테스트 편향의 가능성을 고려할 때 중요합니다. 이 기사는 세 가지 다른 표면에서 자란 생물막에 일반적으로 사용되는 수확 및 분해 기술을 보여줍니다. 광범위한 문헌 검토에서 수집 된 세 가지 생물막 수확 및 분해 기술에는 볼텍싱 및 초음파 처리, 긁기 및 균질화, 긁기, 볼텍싱 및 초음파 처리가 포함됩니다. 두 가지 표면 유형이 고려됩니다 : 경질 비 다공성 (폴리 카보네이트 및 붕규산염 유리)과 다공성 (실리콘). 또한 우리는 수확 기술을 보고 할 때 포함되어야하는 최소 정보에 대한 권장 사항과 편향을 검사하기위한 동반 방법을 제공합니다.
Introduction
생물막의 정의는 지난 수십 년 동안 진화해 왔으며 다양한 생물학적 및/또는 비생물학적 표면과의 미생물 연관성을 포함하며, 매트릭스 내에서 서로 다른 성장과 유전자 발현을 나타내는 비세포 성분1을 포함한다2. 생물막은 건조와 같은 환경 스트레스로부터 보호를 제공하며 화학 소독제의 작용을 덜 효과적으로 만들어 미생물의 생존을 초래할 수 있습니다. 생물막 내의 생존자들은 잠재적으로 공중 보건 관심사인 병원성 미생물의 공급원을 제공할 수 있다3.
생물막 방법은 성장, 처리, 샘플링 (수확 및 분해) 및 분석의 네 단계로 구성됩니다. 사용자가 유기체 성장 조건, 온도, 배지 등을 결정하는 첫 번째 단계인 성장은 생물막 문헌4,5,6,7에서 가장 많이 고려되고 보고된다. 처리 단계는 성숙한 생물막3,8,9에 대한 그들의 효능을 결정하기 위해 항미생물제 (예를 들어, 소독제)를 평가하거나 항미생물이 생물막 성장을 예방하거나 감소시키는 생성물의 능력을 결정하기 위해 표면에 혼입될 수 있다10. 세 번째 단계, 샘플링은, 그것이 성장하던 표면으로부터 생물막을 수확하고 제거된 덩어리를 분해하는 단계3,8,11를 포함한다. 네 번째 단계인 분석은 실행 가능한 세포 계수, 현미경, 형광 측정, 분자 결과, 및/또는 매트릭스 성분 평가8,9를 포함할 수 있다. 데이터 평가는 실험 결과에 대한 정보를 제공합니다. 네 가지 중 샘플링은 종종 가장 간과되는 단계인데, 이는 선택된 생물막 수확 및/또는 분해 기술이 100% 효과적이며, 종종 검증 없이 효과적이라고 가정하기 때문이다11.
종종 균질한 것으로 간주되는 박테리아의 플랑크톤 현탁액은 분석 전에 간단한 볼텍싱이 필요합니다. 그러나 생물막은 미생물(원핵 및/또는 진핵생물), 외래다당류, 단백질, 지질, 세포외 DNA 및 숙주 세포로 구성된 복잡한 군집이다12. 전통적인 플랑크톤 미생물 배양 방법을 넘어서는 단계는 표면에서 생물막을 적절하게 수확 한 다음 균질 한 단일 세포 현탁액으로 분해하기 위해 필요합니다. 광범위한 문헌 검토 (이 간행물에 포함되지 않은 정보)는 제거 및 응집 기술의 선택이 생물막에 존재하는 종, 생물막이 부착되는 표면 (비다공성 또는 다공성), 성장 표면에 대한 접근성 (쉽게 제거 가능한 쿠폰 또는 생물막이 성장하는 장치의 물리적 파괴)을 포함한 여러 요인에 의존한다는 것을 입증했습니다. 표면 기하학 (면적 및 모양), 성장 표면의 생물막 밀도 및 사용 가능한 실험실 장비.
생물막이 표면으로부터 수확될 때, 생성된 세포 현탁액은 이질적이다. 이러한 불균일한 현탁액이 정확하게 열거되려면, 개별 세포로 분해되어야 한다. 실행 가능한 플레이트 카운트는 콜로니 형성 단위가 하나의 박테리아에서 유래했다고 가정합니다. 생물막의 응집체가 성장 배지 상에 놓여진다면, 부정확한 추정으로 이어질 수 있는 개별 세포를 구별하는 것은 불가능하다. 예를 들어, 소독제 효능 시험 동안, 만약 치료가 대조군에 비해 표면으로부터 생물막을 매우 효과적으로 제거한다면, 로그 감소는 대조군에 비해 인위적으로 크게 나타날 수 있다. 한편, 생물막을 표면에 고정시키는 화학적 소독제는 대조군에 비해 더 낮은 로그 감소를 갖는 것으로 보일 것이다11. 이러한 유형의 시나리오는 실험 데이터에 대한 편향된 해석으로 이어질 수 있습니다.
출판을 준비하면서, 문헌의 검토는 생물막을 수확하고 분해하는 일반적인 접근법이 긁힘, 면봉, 초음파 처리, 볼텍싱 또는 이들의 조합을 포함한다는 것을 결정했다. 긁는 것은 멸균 스틱, 주걱 또는 기타 도구가있는 표면에서 생물막을 물리적으로 제거하는 것으로 정의됩니다. 면봉은 면이 기울어진 스틱 또는 다른 고정 흡수성 물질로 표면으로부터 생물막을 제거하는 것을 말한다. 초음파 처리는 물을 통해 분포 된 초음파를 통해 표면에서 생물막이 파괴되는 것을 말합니다. 볼텍싱은 튜브 내부의 샘플의 액체 와류를 달성하기 위해 믹서를 사용하는 것을 말합니다. 균질화는 회전 블레이드를 사용하여 수확된 생물막 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 전단합니다. 이 논문에서는 경질 / 비 다공성 및 다공성의 두 가지 표면 유형에 대한 세 가지 수확 및 분해 방법을 제시합니다.
연구자가 출판물의 방법 섹션에 포함시켜야하는 권장 최소 정보 목록이 제공됩니다. 우리는이 정보를 포함하면 다른 연구자가 자신의 연구를 재현 할 수 있기를 바랍니다. 완벽한 수확 및 분해 방법이 없으므로 기술을 확인하는 방법에 대한 권장 사항도 제공됩니다.
일반적인 성장 표면에서 생물막을 수확하고 분해하는 세 가지 일반적인 방법이 이 기사에서 입증된다. 이 정보를 통해 연구원은 생물막 테스트 방법의 전반적인 정밀도와 편향성을 더 잘 이해할 수 있습니다. 기술된 방법은 다음과 같다: (1) CDC 생물막 반응기에서 높은 유체 전단 하에서 폴리카보네이트 쿠폰(경질 비다공성 표면) 상에서 성장한 슈도모나스 aeruginosa 생물막은 생물막 수확 및 붕산을 달성하기 위해 볼텍싱과 초음파 처리의 다섯 단계 조합에 따라 수확 및 분해된다 (2) A P. aeruginosa 저유체 전단 하에서 점적 유동 반응기에서 붕규산염 유리 쿠폰 (경질 비다공성 표면) 상에서 성장한 생물막은 스크래핑 및 균질화를 사용하여 수확 및 분해된다 (3) 실리콘 튜빙 (다공성 표면)에서 성장한 에스케리치아 콜리 생물막은 스크래핑을 사용하여 수확 및 분해되고, 이어서 초음파 처리 및 볼텍싱된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수확 및 분해 방법에 대한 최소 정보
과학계에 걸쳐 재현 가능한 생물막 데이터를 작성하려면 저자가 생물막 방법의 성장, 치료, 샘플링 및 분석 단계에 대해 가능한 한 많은 세부 사항을 포함시켜야합니다. 생물막 방법의 표준화는 연구자가 특정 방법과 관련 수정을 참조 할 수있게 해주기 때문에 이러한 노력에 도움이되었습니다. 그러나 많은 논문에는 생물막 수확 및 분해를 설?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers 및 Fei San Lee가이 논문에 기여한 것을 인정하고 싶습니다.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
Referências
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