Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.
Abstract
La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) es una técnica molecular poderosa y ampliamente utilizada para mapear las ubicaciones del genoma completo de los factores de transcripción (TF), los reguladores de cromatina y las modificaciones de histonas, así como para detectar genomas completos para descubrir patrones de unión a TF y modificaciones posttraduccionales de histonas. Las actividades modificadoras de la cromatina, como la metilación de histonas, a menudo se reclutan para secuencias reguladoras de genes específicas, causando cambios localizados en las estructuras de la cromatina y dando lugar a efectos transcripcionales específicos. La explosión del arroz es una enfermedad fúngica devastadora en el arroz en todo el mundo y es un sistema modelo para estudiar la interacción hongo-planta. Sin embargo, los mecanismos moleculares en la forma en que las modificaciones de histonas regulan sus genes de virulencia en Magnaporthe oryzae siguen siendo esquivos. Más investigadores necesitan usar ChIP-seq para estudiar cómo la modificación epigenética de histonas regula sus genes objetivo. ChIP-seq también se utiliza ampliamente para estudiar la interacción entre la proteína y el ADN en animales y plantas, pero es menos utilizado en el campo de la fitopatología y no ha sido bien desarrollado. En este artículo, describimos el proceso experimental y el método de operación de ChIP-seq para identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3) que se une a los genes diana funcionales en M. oryzae. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.
Introduction
La epigenética es una rama de la investigación genética que se refiere al cambio heredable de la expresión génica sin cambiar la secuencia de nucleótidos de los genes. Un número creciente de estudios han demostrado que la regulación epigenética juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las células eucariotas, incluida la cromatina que regula y afecta la expresión génica a través del proceso dinámico de plegamiento y ensamblaje en estructuras de orden superior1,2. La remodelación de la cromatina y la modificación de las histonas covalentes afectan y regulan la función y estructura de la cromatina a través de la variación de los polímeros de cromatina, logrando así la función de regular la expresióngénica 3,4,5,6. Las modificaciones posttraduccionales de la histona incluyen acetilación, fosforilación, metilación, monoubiquitinación, sumoilación y ribosilación ADP7,8,9. La metilación de la histona H3K4, particularmente la trimetilación, se ha mapeado a los sitios de inicio de la transcripción donde se asocia con la replicación de la transcripción, la recombinación, la reparación y el procesamiento de ARN en eucariotas10,11.
La tecnología ChIP-seq se introdujo en 2007 y se ha convertido en el estándar experimental para el análisis de todo el genoma de la regulación transcripcional y los mecanismos epigenéticos12,13. Este método es adecuado a escala de todo el genoma y para obtener información de interacción de histonas o factores de transcripción, incluidos los segmentos de ADN de las proteínas de unión al ADN. Cualquier secuencia de ADN entrecruzada a proteínas de interés coprecipitará como parte del complejo de cromatina. Las técnicas de secuenciación de nueva generación también se utilizan para secuenciar 36-100 pb de ADN, que luego se emparejan con el genoma objetivo correspondiente.
En hongos fitopatógenos, la investigación ha comenzado recientemente a estudiar cómo las modificaciones de metilación de histonas regulan sus genes diana en el proceso de patogenicidad. Algunos estudios previos demostraron que la regulación de los genes relacionados con la histona metilasa se refleja principalmente en el silenciamiento génico y la catalización de la producción de metabolitos secundarios (SM). MoSet1 es la H3K4 metilasa en M. oryzae. La eliminación de este gen da como resultado la eliminación completa de la modificación H3K4me314. En comparación con la cepa de tipo salvaje, la expresión del gen MoCEL7C en el mutante se inhibe en el estado inducido por CMC y en el estado no inducido (glucosa o celobiosa), la expresión de MoCEL7C aumentó15. En Fusarium graminearum,KMT6 puede catalizar la modificación de la metilación de H3K27me3, regular el desarrollo normal de hongos y ayudar a regular el “genoma críptico” que contiene el grupo de genes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly informó que la metilación de H3K9 y H3K27 regula el proceso patogénico de los hongos a través de metabolitos secundarios y factores efectores que regulan la inhibición de los genes diana20. En Aspergillus,la modificación de las histonas H3K4me2 y H3K4me3 está relacionada con la activación génica y juega un papel importante en el control de la regulación del nivel de cromatina de los grupos de genes SM21. En M. oryzae,Tig1 (homólogo a Tig1 en levaduras y mamíferos) es un HADC (histona desacetilasa)22. La eliminación del gen Tig1 conduce a la pérdida completa de la patogenicidad y la capacidad de producción de esporas en el mutante nulo. Es más sensible a un ambiente de peroxígeno, que no puede producir hifas infecciosas22.
La explosión de arroz causada por M. oryzae. es una de las enfermedades más graves del arroz en la mayoría de las zonas de cultivo de arroz en el mundo19. Debido a su proceso de infección representativo, M. oryzae es similar al proceso de infección de muchos hongos patógenos importantes. Como puede llevar a cabo fácilmente operaciones genéticas moleculares, el hongo se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de las interacciones fúngico-planta23. El bloqueo de cada paso del proceso de infección de M. oryzae puede resultar en una infección fallida. Los cambios morfológicos durante el proceso de infección están estrictamente regulados por la función completa del genoma y la transcripción de genes. Entre ellas, las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas juegan un papel esencial en la regulación transcripcional de los genes funcionales24,25. Sin embargo, hasta ahora, se han realizado pocos estudios sobre el mecanismo molecular de las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y la acetilación de histonas en la transcripción de genes de patogénesis en M. oryzae. Por lo tanto, desarrollar aún más el mecanismo de regulación epigenética del hongo de la explosión de arroz mientras se investiga en la red reguladora aguas arriba y aguas abajo de estos genes patógenos relacionados ayudará a desarrollar estrategias de prevención y control de la explosión de arroz.
Con el desarrollo de la genómica funcional como ChIP-seq, especialmente en epigenética, este método de adquisición de datos de alto rendimiento ha acelerado la investigación sobre los cromosomas. Utilizando la tecnología experimental ChIP-seq, se puede identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) en M. oryzae y otros hongos filamentosos. Por lo tanto, este método puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a cómo las modificaciones epigenéticas regulan sus genes diana candidatos durante la patogénesis fúngica en la patología vegetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recientemente, ChIP-seq se ha convertido en un método de análisis genómico ampliamente utilizado para determinar los sitios de unión de TFs o sitios de enriquecimiento modificados por histonas específicas. En comparación con la tecnología ChIP-seq anterior, la nueva tecnología ChIP-seq es altamente sensible y flexible. Los resultados se proporcionan en alta resolución sin efectos negativos, como la señal de ruido causada por la hibridación inespecífico de ácidos nucleicos. Aunque este es un análisis de expr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención no. 31871638), el Proyecto Especial de Investigación Científica de la Universidad de Agricultura de Beijing (YQ201603), el Proyecto Científico del Comité Educativo de Beijing (KM201610020005), el proyecto de cultivo de investigación científica de alto nivel de BUA (GJB2021005).
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
Referências
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