Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi
Summary
Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kromatin immünorektasyon dizilimi (ChIP-seq), transkripsiyon faktörlerinin (TF’ler), kromatin düzenleyicilerinin ve histone modifikasyonlarının tüm genom konumlarını haritalamak ve TF bağlama kalıplarını ve histone posttranslational modifikasyonlarını ortaya çıkarmak için tüm genomları tespit etmek için güçlü ve yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Histone metilasyonu gibi kromatin değiştirme faaliyetleri genellikle belirli gen düzenleyici dizilere alınarak kromatin yapılarında lokalize değişikliklere neden olmakta ve belirli transkripsiyon etkilerine neden olmaktadır. Pirinç patlaması, dünya çapında pirinç üzerinde yıkıcı bir mantar hastalığıdır ve mantar bitki etkileşimini incelemek için örnek bir sistemdir. Bununla birlikte, histone modifikasyonlarının Magnaporthe oryzae’deki virülans genlerini nasıl düzenlediğine dair moleküler mekanizmalar zor kalır. Daha fazla araştırmacı, histone epigenetik modifikasyonun hedef genlerini nasıl düzenlediğini incelemek için ChIP-seq’i kullanmaktadır. ChIP-seq, hayvanlarda ve bitkilerde protein ve DNA arasındaki etkileşimi incelemek için de yaygın olarak kullanılır, ancak bitki patolojisi alanında daha az kullanılır ve iyi gelişmemiştir. Bu yazıda, M. oryzae’deki fonksiyonel hedef genlere bağlanan histone metilasyonunun (H3K4me3 gibi) genom çapındaki dağılımını tanımlamak için ChIP-seq’in deneysel sürecini ve çalışma yöntemini açıklıyoruz. Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.
Introduction
Epigenetik, genlerin nükleotid dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunun kalıtsal değişimini ifade eden bir genetik araştırma dalıdır. Giderek artan sayıda çalışma, epigenetik regülasyonun, daha yüksek sıralı yapılara katlama ve montaj dinamik süreci ile gen ekspresyonını düzenleyen ve etkileyen kromatin de dahil olmak üzere ökaryotik hücrelerin büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir1,2. Kromatin remodeling ve kovalent histone modifikasyonu kromatin polimerlerinin varyasyonu yoluyla kromatin fonksiyonunu ve yapısını etkiler ve düzenler, böylece gen ekspresyonunu düzenlemeişlevineulaşılır 3 ,4,5,6. Histone posttransilasyon modifikasyonları arasında asetilasyon, fosforilasyon, metilasyon, monoubiquitination, sumoylation ve ADP ribosilasyon7,8,9bulunur. Histone H3K4 metilasyonu, özellikle trimetilasyon, ökaryot 10,11’detranskripsiyon replikasyonu, rekombinasyon, onarım ve RNA işleme ile ilişkili olduğu transkripsiyon başlangıç sitelerine eşlenmiştir.
ChIP-seq teknolojisi 2007 yılında piyasaya sürlenmiştir ve transkripsiyonel regülasyon ve epigenetik mekanizmaların genom çapında analizi için deneysel standart haline gelmiştir12,13. Bu yöntem genom çapında ölçekte ve DNA bağlayıcı proteinlerin DNA segmentleri de dahil olmak üzere histone veya transkripsiyon faktörü etkileşim bilgilerini elde etmek için uygundur. İlgi çekici proteinlere çapraz bağlı dna dizileri kromatin kompleksinin bir parçası olarak bir arada olacaktır. Yeni nesil dizileme teknikleri, daha sonra ilgili hedef genomla eşleşen 36-100 bp DNA’yı sıralamak için de kullanılır.
Fitopatojenik mantarlarda, araştırmalar son zamanlarda histone metilasyon modifikasyonlarının patojeniklik sürecinde hedef genlerini nasıl düzenlediğini incelemeye başlamıştır. Daha önceki bazı çalışmalar, histone metil ile ilgili genlerin düzenlenmesinin esas olarak sekonder metabolitlerin (SM) üretiminin gen susturma ve katalzingine yansıdığını kanıtlamıştır. MoSet1, M. oryzae’deki H3K4 metilatlazıdır. Bu genin nakavtı, H3K4me3 modifikasyonunun tamamen silinmesine neden olur14. Vahşi tip suşla karşılaştırıldığında, mutanttaki MoCEL7C geninin ekspresyolü CMC kaynaklı durumda ve indüklenmemiş durumda (glikoz veya selobiyoz) inhibe edilir, MoCEL7C ekspresyolü15arttı . Fusarium graminearumdaKMT6, H3K27me3’ün metilasyon modifikasyonuna kataliz edebilir, mantarların normal gelişimini düzenleyebilir ve SM gen kümesi16 , 17 , 18,19’uiçeren “şifreli genomu” düzenlemeye yardımcı olabilir. 2013 yılında Connolly, H3K9 ve H3K27 metilasyonunun, hedef genlerin inhibisyonunu düzenleyen ikincil metabolitler ve efektör faktörler yoluyla mantarların patojenik sürecini düzenlediğini bildirdi20. Aspergillus’ta,H3K4me2 ve H3K4me3 histonlarının modifikasyonu gen aktivasyonu ile ilgilidir ve SM gen kümelerinin kromatin seviyesi regülasyonunun kontrolinde önemli bir rol oynar21. M. oryzae, Tig1 (maya ve memelilerde Tig1’e homolog) bir HADC (histone deacetylase)22. Tig1 geninin nakavtı, boş mutantta patojenite ve spor üretim yeteneğinin tamamen kaybına yol açar. Enfektif hyphae22üretemeyen peroksijen ortamına karşı daha hassastır.
M. oryzae.’nin neden olduğu pirinç patlaması, dünyadaki çoğu pirinç yetiştirme alanında en ciddi pirinç hastalıklarından biridir19. Temsili enfeksiyon süreci nedeniyle, M. oryzae birçok önemli patojenik mantarın enfeksiyon sürecine benzer. Moleküler genetik operasyonları kolayca gerçekleştirebildiği için, mantar mantar-bitki etkileşimlerini incelemek için örnek bir organizma haline gelmiştir23. M. oryzae enfeksiyon sürecinin her adımını bloke edilmesi başarısız enfeksiyona neden olabilir. Enfeksiyon sürecindeki morfolojik değişiklikler, tüm genom fonksiyonu ve gen transkripsiyonu tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bunlar arasında, histone metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar fonksiyonel genlerin transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli bir rol oynar24,25. Bununla birlikte, M. oryzae’deki patogenez genlerinin transkripsiyonunda histone metilasyonu ve histone asetilasyonu gibi epigenetik modifikasyonların moleküler mekanizması üzerinde şimdiye kadar çok az çalışma yapılmıştır. Bu nedenle, bu patojenik ilgili genlerin yukarı ve aşağı akış düzenleyici ağını araştırırken pirinç patlaması mantarının epigenetik düzenleme mekanizmasının daha da geliştirilmesi, pirinç patlaması önleme ve kontrol stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
ChIP-seq gibi fonksiyonel genomiklerin gelişmesiyle, özellikle epigenetikte, bu yüksek verimli veri toplama yöntemi kromozomlar üzerine araştırmaları hızlandırmıştır. ChIP-seq deneysel teknolojisini kullanarak, M. oryzae ve diğer filamentli mantarlarda histone metilasyonunun (H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3 gibi) genom çapındaki dağılımı tanımlanabilir. Bu nedenle, bu yöntem, epigenetik değişikliklerin bitki patolojisinde mantar patogenezinde aday hedef genlerini nasıl düzenlediğinin altında bulunan moleküler mekanizmaların aydınlatıcı yapılmasına yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son zamanlarda, ChIP-seq, belirli histonlar tarafından değiştirilen TF’lerin veya zenginleştirme sitelerinin bağlama alanlarını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir genomik analiz yöntemi haline gelmiştir. Önceki ChIP-seq teknolojisine kıyasla, yeni ChIP-seq teknolojisi son derece hassas ve esnektir. Sonuçlar, nükleik asitlerin spesifik olmayan melezleştirilmesinden kaynaklanan gürültü sinyali gibi olumsuz etkiler olmadan yüksek çözünürlükte sağlanır. Bu yaygın bir gen ekspresyon anal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (grant no. 31871638), Pekin Tarım Üniversitesi Özel Bilimsel Araştırma Projesi (YQ201603), Pekin Eğitim Komitesi Bilimsel Projesi (KM201610020005), BUA’nın üst düzey bilimsel araştırma yetiştirme projesi (GJB2021005) tarafından desteklendi.
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
Referências
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
