Préparation d’homogénats de muscles squelettiques de rat pour les mesures de nitrates et de nitrites
Summary
Nous présentons des protocoles pour trois méthodes différentes d’homogénéisation de quatre groupes musculaires différents de tissu musculaire squelettique de rat afin de mesurer et de comparer les niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, nous comparons différents poids d’échantillon pour déterminer si la taille de l’échantillon de tissu affecte les résultats de l’homogénéisation.
Abstract
On pensait autrefois que les ions nitrate (NO3–) étaient des produits finaux inertes du métabolisme de l’oxyde nitrique (NO). Cependant, des études antérieures ont démontré que les ions nitrate peuvent être reconvertis en NO chez les mammifères par un mécanisme de réduction en deux étapes: le nitrate étant réduit en nitrite (NO2–) principalement par des bactéries commensales orales, puis le nitrite étant réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris via des protéines contenant de l’hème ou du molybdène. Cette voie réductrice du nitrate contribue à améliorer les voies de signalisation médiées par le NO, en particulier dans le système cardiovasculaire et pendant l’exercice musculaire. Les niveaux de nitrate dans l’organisme avant cette utilisation sont déterminés par deux sources différentes: l’oxydation endogène du NO et l’apport alimentaire en nitrates, principalement à partir de plantes. Pour élucider le cycle complexe du NO dans des circonstances physiologiques, nous avons examiné plus en détail la dynamique de ses métabolites, les ions nitrate et nitrite, qui sont relativement stables par rapport au NO. Dans des études antérieures, le muscle squelettique a été identifié comme un organe de stockage majeur pour les ions nitrate chez les mammifères, ainsi qu’une source directe de NO pendant l’exercice. Par conséquent, l’établissement d’une méthodologie fiable pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans le muscle squelettique est important et devrait être utile pour étendre son application à d’autres échantillons de tissus. Cet article explique en détail la préparation d’échantillons de muscles squelettiques, à l’aide de trois méthodes d’homogénéisation différentes, pour les mesures de nitrate et de nitrite et aborde des questions importantes liées aux processus d’homogénéisation, y compris la taille des échantillons. Les concentrations de nitrate et de nitrite ont également été comparées dans quatre groupes musculaires différents.
Introduction
L’oxyde nitrique (NO), une petite molécule de signalisation gazeuse, joue un rôle essentiel dans les processus physiologiques et physiopathologiques1. Le NO peut être produit à partir de la L-arginine par des enzymes endogènes de la famille des oxydes nitriques synthases (NOS) avant de subir une oxydation rapide en nitrate (NO 3-) et, éventuellement, en nitrite (NO 2–) dans le sang et les tissus 2,3. Récemment, il a été démontré que ces anions sont réduits à NO dans les systèmes de mammifères4. Le nitrate est converti en nitrite, principalement par les nitrates réductases bactériennes commensales dans la cavité buccale agissant sur les ions sécrétés par les glandes salivaires et directement ingérés 5, et dans une certaine mesure, par des enzymes de mammifères telles que la xanthine oxydoréductase 6,7. Le nitrite peut être réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris la désoxyhémoglobine8, la désoxymyoglobine9, les enzymes contenant du molybdène 10 et la réduction non enzymatique en présence de protons11,12.
Cette voie nitrate-nitrite-NO est améliorée dans des conditions hypoxiques où l’activité NOS est diminuée parce que NOS a besoin d’oxygène pour la générationde NO 4. De nombreuses études récentes ont rapporté des effets bénéfiques du nitrate alimentaire sur la régulation de la pression artérielle et la performance physique, suggérant que les voies de réduction des nitrates contribuent à l’augmentation de la signalisation du NO13,14,15. Des études antérieures ont montré que certains muscles squelettiques sont probablement les principaux lieux de stockage des nitrates dans le corps16. Comparé au sang ou à d’autres organes internes tels que le foie, le muscle squelettique (grand fessier) contient des niveaux significativement plus élevés de nitrate et a une masse substantielle dans le corps des mammifères. Il a été démontré que l’exercice sur tapis roulant améliorait la réduction des nitrates en nitrite et en NO dans les fessiers chez un rat modèle7. Ces résultats impliquent que certains muscles squelettiques pourraient être des sources importantes de NO par des voies de réduction des nitrates dans des situations physiologiques. Des études plus récentes suggèrent que ces résultats, y compris les changements dans les niveaux de nitrate musculaire pendant l’exercice, se produisent également chez les humains17.
Deux des auteurs actuels avaient déjà établi une méthode pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les échantillons de sang et d’autres liquides18. Cependant, lorsque les niveaux de ces anions dans les homogénats tissulaires ont été initialement analysés, les protocoles détaillés n’étaient pas disponibles. Pour comprendre la dynamique nitrate-nitrite-NO dans plusieurs organes différents, notre objectif était de développer une méthode précise et efficace pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans les tissus de mammifères, y compris le muscle squelettique. Dans des études antérieures, des tissus de rongeurs ont été utilisés pour développer des processus d’homogénéisation fiables, puis analyser les teneurs en nitrates et nitrites dans ces homogénats 7,16,19. L’utilisation de cette méthode d’homogénéisation a été étendue aux échantillons de biopsie du muscle squelettique humain, où les valeurs ont été confirmées et, surtout, les valeurs observées pour le muscle par rapport au sang / plasma étaient dans des plages et des rapports similaires à ceux observés chez les rongeurs17. Au cours des dernières années, d’autres groupes ont également commencé à mesurer les niveaux de nitrates et de nitrites dans les homogénats des muscles squelettiques, rapportant des valeurs comparables à celles rapportées par notre groupe20,21.
Le but de ce document de protocole est de décrire en détail la préparation d’homogénats de muscles squelettiques en utilisant trois méthodes d’homogénéisation différentes pour la mesure ultérieure des niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, les effets du poids tissulaire utilisé pour l’homogénéisation sur les valeurs de nitrate et de nitrite dans les échantillons de muscles squelettiques ont été examinés. Nous croyons que ces méthodes peuvent être facilement appliquées à d’autres types de tissus de mammifères. Récemment, en particulier dans le domaine de la physiologie de l’exercice, une attention particulière a été accordée aux différences possibles de physiologie nitrate/nitrite/NO selon les groupes musculaires. Nous rapportons également les quantités de nitrate et de nitrite dans quatre muscles de rongeurs différents et trouvons une distribution non uniforme des deux ions entre ces différents muscles; une observation qui nécessite une étude plus approfondie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour surveiller l’évolution des métabolites du NO, nitrate et nitrite, en fonction des interventions physiologiques, il est impératif de mesurer les niveaux de ces ions dans les différents organes critiques dans leur métabolisme. Comme l’hémoglobine dans le sang réagit avec le NO et ses métabolites, il est également important de prélever le sang rapidement des échantillons de tissus autant que possible. Ainsi, les animaux ont été perfusés avec une solution saline avant de recueillir les tissus musculair…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention intra-muros NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 à Alan N Schechter, MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
Referências
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