Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması
Summary
Nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için sıçan iskelet kası dokusunun dört farklı kas grubunun homojenizasyonu için üç farklı yöntem için protokoller sunuyoruz. Ayrıca, doku numune büyüklüğünün homojenizasyon sonuçlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için farklı numune ağırlıklarını karşılaştırıyoruz.
Abstract
Nitrat iyonlarının (NO3–) bir zamanlar nitrik oksit (NO) metabolizmasının inert son ürünleri olduğu düşünülüyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, nitrat iyonlarının memelilerde iki aşamalı bir indirgeme mekanizması ile NO’ya geri dönüştürülebileceğini göstermiştir: nitrat, çoğunlukla oral kommensal bakteriler tarafından nitrite (NO2–) indirgenir, daha sonra nitrit, heme veya molibden içeren proteinler de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar tarafından NO’ya indirgenir. Bu indirgeyici nitrat yolu, özellikle kardiyovasküler sistemde ve kas egzersizi sırasında NO-aracılı sinyal yolaklarının geliştirilmesine katkıda bulunur. Bu tür bir kullanımdan önce vücuttaki nitrat seviyeleri iki farklı kaynak tarafından belirlenir: endojen NO oksidasyonu ve diyet nitrat alımı, esas olarak bitkilerden. Fizyolojik koşullarda karmaşık NO döngüsünü aydınlatmak için, NO’ya kıyasla nispeten kararlı olan metabolitlerinin, nitrat ve nitrit iyonlarının dinamiklerini daha fazla inceledik. Önceki çalışmalarda iskelet kası, memelilerde nitrat iyonları için önemli bir depolama organı ve egzersiz sırasında doğrudan bir NO kaynağı olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, iskelet kasındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için güvenilir bir metodoloji oluşturmak önemlidir ve uygulamasının diğer doku örneklerine genişletilmesinde yardımcı olmalıdır. Bu yazıda, nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası numunelerinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmakta ve numunelerin büyüklüğü de dahil olmak üzere homojenizasyon prosesleri ile ilgili önemli konular tartışılmaktadır. Nitrat ve nitrit konsantrasyonları da dört farklı kas grubunda karşılaştırılmıştır.
Introduction
Küçük bir gaz halindeki sinyal molekülü olan nitrik oksit (NO), fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerde kritik bir rol oynar1. NO, nitrik oksit sentaz (NOS) ailesinin endojen enzimleri tarafından L-arginin’den, nitrata (NO 3-) ve muhtemelen kandaki ve dokulardaki nitrite (NO 2–) hızlı oksidasyona uğramadan önce üretilebilir 2,3. Son zamanlarda, bu anyonların memeli sistemlerinde NO’ya geri indirgendiği gösterilmiştir4. Nitrat, esas olarak tükürük bezleri tarafından salgılanan ve doğrudan yutulan iyonlara etki eden ağız boşluğundaki kommensal bakteriyel nitrat redüktazları tarafından nitrite dönüştürülür 5 ve bir dereceye kadar ksantin oksidoredüktaz 6,7 gibi memeli enzimleri tarafından. Nitrit, deoksihemoglobin8, deoksimiyoglobin9, molibden içeren enzimler10 ve proton 11,12 varlığında enzimatik olmayan indirgeme dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla NO’ya daha da indirgenebilir.
Bu nitrat-nitrit-NO yolu, NOS aktivitesinin azaldığı hipoksik koşullar altında geliştirilir, çünkü NOS NO nesil4 için oksijen gerektirir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, diyet nitratının kan basıncı regülasyonu ve egzersiz performansı üzerindeki yararlı etkilerini bildirmiştir, bu da nitrat azaltma yollarının NO sinyalinin 13,14,15’in artmasına katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Önceki çalışmalar, bazı iskelet kaslarının muhtemelen vücuttaki başlıca nitrat depolama yerleri olduğunu göstermiştir16. Kan veya karaciğer gibi diğer iç organlarla karşılaştırıldığında, iskelet kası (gluteus maximus) önemli ölçüde daha yüksek nitrat seviyeleri içerir ve memeli vücudunda önemli bir kütleye sahiptir. Koşu bandı egzersizinin, bir sıçan modeli7’de nitrite ve gluteustaki NO’ya nitrat indirgemesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bazı iskelet kaslarının fizyolojik durumlarda nitrat indirgeme yolları yoluyla NO için önemli kaynaklar olabileceğini düşündürmektedir. Daha yeni çalışmalar, egzersiz sırasında kas nitrat seviyelerindeki değişiklikler de dahil olmak üzere bu bulguların insanlarda da meydana geldiğini göstermektedir17.
Mevcut yazarlardan ikisi daha önce kan ve diğer sıvı numunelerdeki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için bir yöntem oluşturmuştu18. Bununla birlikte, bu anyonların doku homojenatlarındaki seviyeleri başlangıçta analiz edildiğinde, ayrıntılı protokoller mevcut değildi. Birkaç farklı organdaki nitrat-nitrit-NO dinamiklerini anlamak için amacımız, iskelet kası da dahil olmak üzere memeli dokularındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için doğru ve verimli bir yöntem geliştirmekti. Daha önceki çalışmalarda, güvenilir homojenizasyon prosesleri geliştirmek ve daha sonra bu homojenatlardaki nitrat ve nitrit içeriğini analiz etmek için kemirgen dokuları kullanıldı 7,16,19. Bu homojenizasyon yönteminin kullanımı, değerlerin doğrulandığı insan iskelet kası biyopsi örneklerine genişletildi ve daha da önemlisi, kas için kan / plazmaya kıyasla gözlemlenen değerler, kemirgenlerde gözlenenlere benzer aralıklarda ve oranlarda idi17. Son yıllarda, diğer gruplar da iskelet kası homojenatlarındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmeye başladı ve grubumuz20,21 tarafından bildirilenlerle karşılaştırılabilir değerler bildirdi.
Bu protokol belgesinin amacı, nitrat ve nitrit seviyelerinin daha sonraki ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası homojenatlarının hazırlanmasını ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Ayrıca homojenizasyon için kullanılan doku ağırlığının iskelet kası örneklerinde nitrat ve nitrit değerleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemlerin diğer memeli dokularına da rahatlıkla uygulanabileceğine inanıyoruz. Son yıllarda özellikle egzersiz fizyolojisi alanında kas gruplarına göre nitrat/nitrit/NO fizyolojisindeki olası farklılıklara dikkat çekilmiştir. Ayrıca dört farklı kemirgen kasındaki nitrat ve nitrit miktarlarını rapor ediyoruz ve her iki iyonun da bu farklı kaslar arasında eşit olmayan bir dağılımını buluyoruz; daha fazla çalışma gerektiren bir gözlem.
Protocol
Representative Results
Discussion
NO metabolitleri, nitrat ve nitritteki değişiklikleri izlemek için, fizyolojik müdahalelerin bir fonksiyonu olarak, bu iyonların metabolizmalarında kritik olan farklı organlardaki seviyelerini ölçmek zorunludur. Kandaki hemoglobin NO ve metabolitleri ile reaksiyona gireceğinden, kanı doku örneklerinden mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çıkarmak da önemlidir. Böylece iskelet kas dokuları (gluteus, TA, EDL, gastroknemius kası) toplanmadan önce hayvanlar salin ile perfüze edildi ve hedef kas etraf…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Alan N Schechter, MD’ye intramural NIH / NIDDK hibe ZIA DK 0251041-14 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
Referências
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502 (1994).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
