Summary
이 프로토콜은 동일한 쥐 집단을 사용하여 4개의 반복을 사용하여 개체 위치 작업에 대한 자세한 단계를 제공합니다. 약하고 강한 인코딩은 단기 및 장기 기억을 생성 할 수 있습니다. 반복프로토콜의 유연성은 시간과 노동력을 절약하여 외과 수술과 관련된 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Abstract
오브젝트 장소 인식은 설치류에서 공간 메모리를 조사하는 데 사용되는 탁월한 방법입니다. 이 개체 위치 인식 메모리는 개체 위치 작업의 기초를 형성합니다. 이 백서에서는 동일한 쥐 집단을 사용하여 최대 4회 반복할 수 있는 옵션으로 개체 위치 작업의 수립을 안내하는 광범위한 프로토콜을 제공합니다. 약하고 강력한 인코딩 프로토콜을 사용하여 다양한 강도의 단기 및 장기 공간 기억을 연구하고 관련 메모리 억제 또는 강화 조작의 구현을 가능하게 할 수 있습니다. 또한, 여기에 제시된 카운터밸런싱과 함께 테스트의 반복은 쥐 간의 가변성을 줄이기 위해 피험자 내 비교를 위한 두 개 이상의 시험결과의 조합을 허용한다. 이 방법은 통계적 힘을 높이는 데 도움이 되며 특히 개별 동작에서 높은 변동을 생성하는 실험을 실행할 때 강력히 권장됩니다. 이것은 각 동물에게서 얻은 데이터를 증가하고 필요로 하는 동물의 전반적인 수를 감소시킴으로써 연구를 직접 구체화합니다. 마지막으로, 반복되는 물체 위치 작업의 구현은 시간과 노동력을 절약하여 외과 적 시술을 포함하는 연구의 효율성을 증가시킵니다.
Introduction
자발적인식작업(예: 개체 인식, 물체 장소 인식)은 설치류에서 메모리를 조사하는 데 큰 활용되고 있다. 이러한 테스트는 공포 컨디셔닝 또는 보상 동기부여를 기반으로 하는 메모리 평가에 사용되는 다양한 테스트와는 달리 자발적인 인식 작업은 새로운 자극을 향한 자발적인 탐색 적 행동에만 기반을 두고 있습니다. '신론적 선호도'1이라고불리는 이 동작은 설치류뿐만 아니라 다른 포유류 종 및 조류 및 물고기 2와 같은 일부 비 포유류에 내재되어있습니다. 공간 메모리에 의존하는 객체 위치 인식은 객체 위치 작업(공간 객체 인식 작업이라고도 함)을 사용하여 관찰할 수 있다3. 병변 연구는 개체 장소 인식이 그대로 해마4,5가필요하다는 것을 보여주었습니다. 비교적 간단한 훈련 프로토콜과 보강이 없기 때문에이 작업은 많은 연구에서 바람직합니다. 양수 및 음수 보강의 부재는 행동을 유도할 수 있는 추가 매개 변수및 뇌 영역을 최소화합니다. 따라서 여기서의 동작은 중립적이며 호기심과 공간 메모리를 기반으로 하여 공간 메모리의 인코딩, 통합 및 검색에 관련된 메커니즘을 조사할 수 있습니다.
개체 위치 작업에 대한 프로토콜은 일반적으로 몇 분에서 몇 시간마다 다른 지연 기간으로 구분되는 단일 인코딩 및 테스트 시험 세션으로 구성됩니다. 쥐는 동물의 스트레스 수준을 최소화하기 위해 사전에 취급되는 것이 좋습니다, 따라서, 참신에 대한 혐오와 같은 인식 메모리에 영향을 미칠 수있는 행동. 마찬가지로 잘 설계된 습관 프로토콜은 작업 중에 쥐의 자연스러운 행동을 방해할 수 있는 스트레스를 방지하는 데 필수적인 역할을 합니다. 그러나, 처리 및 습관의 정도는 실험실과 실험자 사이에서 크게 다르며, 이는 낮은 복제율6,7,8에기여할 수 있다. 인코딩 평가판에서 쥐는 지정된 두 모서리에 있는 두 개의 동일한 물체가 있는 경기장을 탐험할 시간이 주어집니다. 기간에 의해 지연되는 시험 시험에서 쥐는 동일한 쌍의 물체로 경기장을 탐험 할 시간이 주어지지만 이번에는 그 중 하나가 새로운 위치로 옮겨졌습니다. 쥐에 의해 전시된 자발적인 선호도와 새로운 위치에서 물체를 탐색하는 데 소요되는 시간이 증가하여 개체 위치3의공간 인식 및 메모리를 나타낸다. 인코딩 평가판(반복 기간 및 횟수)을 수정하는 것은 메모리의 강도에 영향을 미칩니다.
연구의 목적에 따라, 인코딩과 시험 시험 사이의 지연의 길이는 단백질 합성 독립적 인 단기 기억 또는 단백질 합성 의존장기 기억을 모델링하기 위해 수정 될 수있다. 따라서 필요에 따라 프로토콜을 조정하여 다양한 연구에 개체 위치 작업을 사용할 수 있습니다. 또한, 약리학 및 광유전학 적 개입과 같은 실험 적 조작의 구현은 생체 이미징에서와 마찬가지로 이러한 시험 사이에도 가능합니다. 동일한 쥐 코호트 내에서 개체 위치 작업의 반복반복을 보고하는 여러 연구9,10이 있습니다. 이것은 한 동물이 반복없이 한 세션이있는 전통적인 사용과 대조됩니다. 그러나 이러한 패러다임의 효과는 철저히 조사되지 않았으며 이를 설명하는 방법 논문도 없습니다. 우리의 지식에, 이것은 또한 체계적으로 각 반복의 결과를 비교하는 동일한 쥐 코호트를 사용하여 최대 4 개의 반복과 개체 위치 작업을 자세히 설명하는 프로토콜의 첫 번째보고 된 설명입니다. 반복은 실험 조건의 균형을 맞추기 위해 테스트 간의 변동성 감소와 피사체 내 비교를 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 작업의 신뢰할 수 있는 반복을 통해 데이터를 풀링할 수 있으므로 상대적으로 적은 수의 쥐를 사용하여 충분히 많은 양의 데이터를 생성할 수 있습니다. 마지막으로, 동일한 쥐를 사용하는 반복은 결과적으로 시간과 인건비를 절약하는 데 필요한 쥐의 수를 줄임으로써 외과 수술 및 이식과 관련된 실험에 도움이 될 수 있습니다.
이 연구는 1h 및 24-h 지연시험 다음에 강하고 약한 인코딩 시험을 사용하여 성인 쥐에서 개체 위치 작업을 수행하는 방법을 자세히 설명하는 광범위한 프로토콜을 제시합니다. 강력한 인코딩 프로토콜은 1-h 및 24-h 지연으로 테스트할 때 통계적으로 유의한 인식 메모리를 생성하므로 이러한 기억을 억제하기 위해 조작의 구현 시 단기 및 장기 기억을 연구하는 데 사용할 수있다. 반면 약한 인코딩 프로토콜은 1h 지연으로 테스트할 때만 상당한 단기 메모리를 생성합니다. 장기 기억의 부재는 메모리11,12의보존을 향상시키기위한 조작을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 개체 위치 작업의 복제가능성을 높이는 것을 목표로 하는 자세한 처리 및 습관 세션도 포함됩니다. 이 논문은 또한 약한 인코딩 프로토콜을 사용하여 쥐의 동일한 코호트를 가진 네 개의 별개의 맥락에서 작업의 반복을 보여 주며, 이는 매번 복제및 일관된 결과를 생성하는 것으로 확인됩니다.
Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 덴마크 및 EU 동물 복지 법규에 따라 덴마크 국가 당국(라이센스 번호: 2018-15-0201-01405)에 의해 승인되었습니다.
1. 실험적인 설정 및 고유한 컨텍스트 준비
- 컨텍스트가 있는 오브젝트 위치 아레나
참고: 아래 설정은 천장의 가장자리를 따라 광원이 있는 밀폐된 방음상자(그림 1B)와상자 천장 중앙에 있는 카메라로 표시됩니다. 경기장은 높이 100cm(그림1B)의벽이 있는 60cm x 60cm의 경기장이 상자 안에 배치되어 주변 방에서 완전히 분리됩니다. 모든 공간 단서는 경기장 안에 있습니다. 이렇게 하면 고유한 컨텍스트를 만드는 프로세스가 간소화됩니다. 벽 주변에 균일 한 커튼이있는 일반 오픈 필드 경기장을 둘러싸고 주변 방에서 비슷한 수준의 격리를 달성 할 수 있습니다.- 폭 60cm, 높이 50cm의 불투명한 비다공성 플라스틱으로 만든 사각형 경기장을 확보하십시오. 자동화 된 소프트웨어 (해당하는 경우)에 의해 쥐의 움직임을 성공적으로 기록하기 위해 쥐의 색상과 대조 바닥에 대한 색상을 선택합니다. 경기장은상자(그림 1B)또는 커튼으로 둘러싸인 플랫폼에 배치합니다.
- 컨텍스트를 만들려면, 다른 색상 및 / 또는 패턴 (예를들어, 검은 색, 흰색, 줄무늬, 점)에 삽입 벽(예를 들어, 경기장과 동일한 재료로 만든 벽 덮개, 또는 쉽게 청소 할 수있는 플라스틱 벽)의 두 번째 층을 얻을. 경기장에 벽의 두 번째 레이어를 삽입하여 서로 구별됩니다.
- 10cm x 10cm x 5cm, 20cm x 15cm x 15cm(너비 x 길이 x 높이) 사이가 다른 치수(3D) 공간 큐(컨텍스트당 1-2)를 얻고(i) 뚜렷한 기하학적 모양과 (ii) 색상이 벽 색상을 대조한다. 쥐가 이 단서에 도달할 수 없도록 충분히 높은 벽에 걸어 놓습니다.
- 다공성, 구치지지 않는, 청소가 쉬운 다양한 개체(컨텍스트 수만큼)를 얻습니다. 각 새 오브젝트에 대해 고유한 기하학적 모양과 텍스처를 사용하는 것을 목표로 합니다. 너비와 높이가 5~15cm 인 객체를 선택합니다(더 높은 개체는 피하십시오). 네 개의 서로 다른 객체(콘, 축구, 직사각형 프리즘 및 삼각형 프리즘)의 예를 보려면 그림 1D를 참조하십시오.
참고: 각 개체는 쥐와 유사해야 모든 개체의 총 탐색 시간을 비교할 수 있습니다. - 경기장 바닥에 물체를 부착하기위한 최상의 솔루션을 찾으십시오(예 : 끈적 끈적한 매트, 양면 테이프 사용, 물체 아래에 금속 판 부착 및 경기장 아래에 페어링 자석 등).
- 다른 컨텍스트를 만들 때 벽을 다시 만들어 이전 컨텍스트에서 벽의 색상과 패턴 분포를 대조합니다. 이전 모든 큐와 는 다른 새로운 3D 공간 큐를 사용합니다. 네 가지 컨텍스트의 예는 그림 1C를 참조하십시오.
- 경기장 내에서 확산되고 동일한 조명을 보장하고 조광기 옵션이 있는 광원을 가져옵니다. 각 컨텍스트를 만든 후 경기장 모서리에 약 100-120 럭스로 빛의 강도를 조정합니다. 카메라를 가져와 상자 천장 중앙에 놓습니다.
참고: 자동 채점 소프트웨어를 사용하지 않을 경우 라이트 강도를 낮은 수준으로 조정할 수 있습니다.
- 오브젝트 버킷
- 버킷(직경 >50cm)을 가져옵니다. 실험 경기장과 유사하지 않도록 사각형 모양을 선택하지 마십시오. 침구 재료로 채웁니다.
- 다른 모양과 크기의 5-10 개체를 얻고 (실험에 사용될 개체와 다른) 무작위로 버킷에 모두 배치(그림 1A).
그림 1: 네 개의 서로 다른 컨텍스트와 개체를 포함하여 실험 설정입니다. (A)객체 습관에 대한 객체 버킷입니다. (B)실험 장치(왼쪽), 물체 위치 경기장, 카메라 및 광원을 둘러싸는 다. 컨텍스트 설정(가운데) 및 컨텍스트 설정이 있는 아레나(오른쪽) 전에 실험 상자와 아레나입니다. (C)뚜렷한 벽색과 패턴, 3차원 공간 큐를 가진 4가지 컨텍스트(1-4). (D)각각 1-4 컨텍스트에서 사용되는 네 개의 객체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 카메라 및 추적 소프트웨어(선택 사항)
- 카메라 레코더를 원격으로 제어하는 데 사용할 수 있고 쥐 코를 추적할 수 있는 소프트웨어를 가져옵니다. 각 실험 전에 각 특정 컨텍스트 및 쥐 변형에 대한 소프트웨어를 조정합니다.
- 개체 위치 및 실험 그룹의 균형 조정
- 인코딩 및 테스트 시험을 위해 가능한 개체 위치 조합을 준비하고 이를 카운터로 지정합니다. 모든 모서리를 개체 위치로 커버하고 대각선 모서리에 인접한 오브젝트 이동및 그 반대의 경우도 마찬가지(그림 2A)와같은 조합을 만듭니다.
- 특정 실험에 대한 일정을 준비하여 한 실험 그룹의 각 쥐를 카운터와 일치시다. 쥐가 충분한 경우, 한 그룹 내에서 두 쌍의카운터(그림 2A)의각 쌍을 사용합니다. 단일 인코딩/테스트세션(그림 2B)에서두 실험 그룹에 대해 동일한 카운터 집합을 사용합니다. 다음세션(즉, 각 새 컨텍스트)에 대한 카운터를 다시 할당합니다.
참고: 인코딩/테스트 세션 동안 쥐를 혼합 순서로실행합니다(예:한 케이지에 있는 모든 쥐를 차례로 실행하지 마십시오. 대신 케이지를 회전시켜 하나 이상의 쥐의 케이지 내에서 차분한 환경을 보장합니다). - 두 개 이상의 컨텍스트를 사용하여 실험군(예를 들어, 1-h 메모리 대 24h 메모리 그룹)의 균형을 맞추는 경우, 각 그룹에 쥐를 할당하고 다음 컨텍스트에서 그룹을 변경한다(도2B).
그림 2: 대표적인 역균형 방법. (A)인코딩 및 시험 시험에서 투기장에서 객체의 가능한 방향이 카운터로 명명된다. 개체 1은 항상 움직이는 개체입니다. 두 개의 카운터마다 서로 균형을 이루어 움직이는 오브젝트의 위치가 변경됩니다. 각 모서리는 두 번 점유되고 오브젝트 1은 대각선에서 인접으로 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. (B)두 개의 불균형 세션에 대한 인코딩/테스트 일정의예(예: 컨텍스트 1 및 2). 쥐는 컨텍스트 1의 실험 조건에 할당됩니다(세션 X, 왼쪽). 카운터 쌍세트(즉, 1-2, 3-4, 5-6 및 7-8)를 하나의 실험 군에서 각 쥐에 선택및 할당한다. 카운터의 동일한 세트는 두 실험 그룹에서 쥐에 할당됩니다. 컨텍스트 2(세션 X+1; 오른쪽)의 다음 세션에서 실험 그룹의 쥐는 카운터 밸런싱을 위해 변경되고 새로운 카운터 쌍 집합이 할당됩니다. 인코딩 및 테스트 시험의 시작 시 시간을 주목해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 이 프로토콜의 모든 처리, 습관 및 인코딩/테스트 세션은 12h 광/어두운 주기의 광단계에서 최적화되어 광상 동안 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
2. 취급 및 습관
- 쥐가 원조 (쥐가 홈 시설에서 사육되는 경우) 또는 실험 시작 2-3 주 (쥐가 외부 시설에서 주문되는 경우, 도착 후 1 주일 동안 적응 할 수 있도록 한 후)에서 시작 쥐를 처리하기 시작합니다.
- 쥐가 편안하게 만지고 실험자가 집어 들 때까지 일주일에 2 또는 3 일 동안 4 마리의 쥐의 각 케이지에 적어도 10-15 분 지출하십시오. 케이지의 쥐 수에 따라 케이지당 할당된 시간을 조정합니다.
참고: 쥐와 함께 일하기를 기대하는 모든 실험자가 취급 중에 존재하는 것이 중요합니다. - 처리가 원고에서 시작되는 경우 이 수준에 도달하면 취급을 최소(선택 사항)로 줄입니다. 실험 2-3주 전에 시작하면 습관 세션이 시작될 때까지 계속 처리하십시오.
- 쥐를 실험실로 가져와 쥐를 실험실로 데려와 실험실에 쥐를 습관화시한다. 쥐가 적어도 30 분 동안 앉아서 진정하고 습관화 할 수있는 시간을 줄 수 있도록하십시오. 이 시간 후, 하우징 룸에 쥐 / 케이지를 반환합니다.
참고: 2.4단계는 처리와 결합하여 필요에 따라 여러 번 반복할 수 있습니다. 프로토콜에 추가조작(예: 주사 절차 처리 등에 대한 처리)을 포함하는 경우 이 단계에서 추가 적인 습관이 구현될 수 있다. - 개체 습관화를 수행하여 쥐를 습관화하여 개체와 상호 작용하고 새로운 환경의 경험에서 비롯된 일반적인 스트레스 수준을 줄입니다.
- 세션 1의 경우 모든 홈 케이지를 실험실로 가져와 쥐가 방에 습관화하여 최소 30 분 동안 정착하게하십시오. 같은 케이지에서 20분 동안 쥐(2-4마리 쥐)를 양동이에 함께 넣습니다. 쥐의 각 그룹 사이의 배설물을 제거하여 양동이를 청소. 모든 케이지에 대한 절차를 반복합니다. 모든 쥐를 집 새장에 넣고 하우징 룸으로 돌아갑니다.
- 세션 2의 경우, 별도의 날에 모든 케이지를 실험실로 가져와 최소 30분 동안 둡니다. 각 쥐를 양동이에 개별적으로 넣고 10분 동안 넣습니다. 쥐를 다시 집 케이지에 넣고 각 쥐 후 양동이를 청소합니다. 모든 케이지를 하우징 룸으로 되돌려 놓습니다.
- 세션 3의 경우 별도의 날에 2.5.2 단계를 반복합니다.
- 실험장치가 밀폐된상자(도 1B)인경우, 새로운 실험 기구에 쥐를 습관화하기 위해 빈 상자 습관을 수행하기로 한다. 세션 4에서는 모든 케이지를 실험실로 가져와 30분 이상 둡니다. 같은 케이지에서 쥐를 함께 배치 (2-4 쥐) 컨텍스트 또는 공간 큐없이 빈 경기장에(그림 1B,중간) 20 분. 모든 쥐를 다시 홈 케이지에 넣고 각 쥐 그룹 후에 70 %의 에탄올로 경기장을 닦으부습니다.
참고: 단계 2.5 및 2.6은 컨텍스트 습관 주간 이전인 한 주에 수행해야 합니다(2.7단계, 그림 3참조). 이 단계 동안 며칠 동안 휴식을 취할 수 있습니다. 그러나 2.7단계를 시작한 후 각 단계는 시험이 끝날 때까지 지정된 대로 연속해서 수행되어야 합니다(단계 2.9). - 일반적인 스트레스 수준을 줄이고 환경의 공간 학습을 지원하기 위해, 컨텍스트 및 3D 큐에 쥐를 습관화컨텍스트 습관을 수행합니다.
- 빈 경기장을 수정하여 섹션 1.1에 설명된 대로 첫 번째 컨텍스트를 만들지만 오브젝트를 경기장에 넣지 는 않습니다. 녹음 장비를 준비합니다.
- 세션 1의 경우 모든 케이지를 실험실로 가져와 최소 30분 동안 둡니다. 수동으로 이 작업을 수행하면 레코더를 시작합니다. 첫 번째 쥐를 경기장 중앙에 놓고 쥐가 경기장을 10 분 동안 탐험 할 수 있습니다. 그런 다음 레코더를 중지 (수동 경우), 다시 홈 케이지에 쥐를 배치합니다. 각 쥐 후 70 %의 에탄올로 경기장을 철저히 닦고 모든 케이지를 하우징 룸으로 반환합니다.
- 세션 2 및 3의 경우, 2일 연속 각 쥐에 대해 2.7.2를 반복하여 쥐당 3회의 문맥 습관이 총편이 있다.
참고: 특히 큰 그룹을 다룰 때 쥐가 경기장에 들어가는 순서를 섞는 것이 좋습니다. 이것은 하루의 동시에 반복적으로 특정 쥐를 실행 방지.
그림 3: 처리, 습관 및 개체 위치 작업 프로토콜을 포함한 행동 실험의 설계입니다. 쥐는 습관주의 주 전에 몇 주부터 정기적으로 처리해야합니다. 0주차에는 개체 및 실험 상자 습관이 4회 이상 수행되며 그 사이에 최소 24시간 간격이 수행됩니다. 1주차에는 24시간 간격으로 3회 연속 세션이 진행되고 인코딩 및 테스트 시험이 진행됩니다. 다음 세션을 진행하기 전에 최소 48h 및 최대 1주일 간격이 있어야합니다(예: 2주 또는 3주차에 다음 컨텍스트에 대한 습관시작). 약어: Hab., 습관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 인코딩 평가판(세션 4)
참고: 약리학 조작의 경우, 약리학제의 특성에 따라 인코딩 시험 전후 또는 시험 시험 전후에 에이전트를 투여하는 적절한 시간이 될 수 있습니다.- 모든 케이지를 실험실로 가져와 서 적어도 30 분 동안 둡니다. 사전에 준비된스케줄(도 2B)을사용하여, 끈적끈적한 매트 나 양면 테이프를 사용하여 지정된 위치에 첫 번째 동일한 쌍의 물체를 배치 (2 모서리와 각 벽에서 >10cm의 거리; L 자형 판지 조각을 사용할 수 있습니다).
- 레코더를 시작합니다(수동인 경우). 첫 번째 쥐를 벽에 마주보고 있거나 물체가 점유하지 않는 모서리를 향합니다(각 오브젝트와 동일한 거리).
참고: 약한 또는 강한 인코딩을 보려면 아래 단계를 따르십시오. - 약한 인코딩 (1 재판)의 경우쥐가 경기장과 물체를 20 분 동안 탐색 할 수 있습니다. 그런 다음 레코더(수동 인 경우)를 중지하고 쥐를 다시 홈 케이지에 배치합니다. 물체를 제거하고 70%의 에탄올로 오브젝트와 경기장을 모두 완전히 닦습니다.
- 각 쥐가 20분의 1인코딩 시험을 받을 수 있도록 모든 쥐에 대해 2.8.3단계를 반복하십시오.
- 강력한 인코딩(3회 시험)의 경우쥐가 경기장과 물체를 5분 동안 탐험할 수 있도록 합니다. 그런 다음 레코더(수동 인 경우)를 중지하고 쥐를 다시 홈 케이지에 배치합니다. 개체를 제거하지 마십시오. 70%의 에탄올로 경기장과 물체를 닦아냅니다.
- 반복 단계 2.8.5 총 3 시험이 있도록 같은 쥐와 두 번 더. 시간이 다 되면 쥐를 다시 홈 케이지에 넣습니다. 물체를 제거하여 철저한 세척을 위해 물체와 경기장을 70% 에탄올로 닦아냅니다.
참고: 쥐에 대한 시험 간 간격은 약 1-2 분이어야합니다. - 각 쥐에 대해 2.8.5-2.8.6 단계를 반복합니다.
- 지연 시간이 24h보다 짧은 경우 시험 시험이 될 때까지 케이지를 실험실에 보관하십시오. 그렇지 않은 경우 모든 케이지를 완료하면 하우징 룸으로 반환합니다.
- 시험 시험 (세션 4)
참고: 지연 기간은 인코딩 평가판 시작부터 계산되어야 합니다.- 24-h 지연(또는 다음 날 시험 시험을 요구하는 지연)의 경우, 모든 케이지를 실험실에 가져와 쥐를 최소 30분 동안 방치할 수 있도록 첫 번째 검사보다 충분한 시간을 남겨 둡다. 일정에 따라 지정된 위치에 개체를 배치합니다(새 위치에 있는 개체 중 하나).
- 시간이 되면 레코더(수동인 경우)를 시작합니다. 첫 번째 쥐를 벽에 마주보고 있거나 물체가 점유하지 않는 모서리를 향합니다(각 오브젝트와 동일한 거리).
- 쥐가 경기장과 물체를 5분 동안 탐험하도록 허용합니다. 그런 다음 레코더를 중지합니다(수동인 경우). 쥐를 다시 홈 케이지에 넣습니다. 물체를 제거하고 70%의 에탄올로 오브젝트와 경기장을 모두 완전히 닦습니다.
- 각 쥐에 대해 2.9.2-2.9.3 단계를 반복합니다. 모든 케이지를 다시 하우징 룸으로 되돌려 놓습니다.
참고: 다음 각 인코딩/테스트 세션에서 최소 48h 및 최대 1주일 간격으로 2.7단계(컨텍스트 습관)에서 습관 프로토콜을 시작합니다.
3. 데이터 분석
- 각 쥐에 대해 이 목적을 위해 설계된 소프트웨어를 사용하거나 수동 설정을 사용하여 인코딩 및 테스트 평가판 모두에서 각 개체에 대한 탐색 시간을 점수매기합니다. 전체 기간 동안 인코딩 평가판을 점수매기기. 최고의 차별 성능3에대한 2 분 에 대한 점수 테스트 시험. 자동화된 온라인 소프트웨어 점수를 사용하는 경우 소프트웨어에서 점수 매기기 데이터를 내보냅니다.
- 쥐가 물체와 접촉하거나 물체를 스니핑하거나 2cm 미만의 거리에서 물체를 마주보고 있을 때 탐색 시간을 계산합니다. 쥐의 주의가 물체 이외의 다른 곳에 나타나지 않는 한 등반과 물체에 앉아 있는 것을포함합니다(예: 물체에서 멀리 보이는 것).
- 각 쥐에 대해 두 개체에 대한 총 탐색 시간을 계산합니다. 신뢰할 수 없는 탐색을 반영할 수 있으므로 이 시험시험(2분 득점)에서 총 탐사 시간이 10초 미만인 쥐를 제외하는 것이 좋습니다.
- 각 개체(방정식 1) 또는 각 래트(수학식 2)에 대한 차별 지수(DI)에 대한 탐색 비율을 계산하고 그룹에 대한 평균 값을 계산합니다.
(1)
참고: % 탐색이 50% 또는 DI가 0인 경우 성능이 확률 수준에 있고 쥐가 두 개체에 대한 선호도가 없음을 의미합니다. 인코딩 시험 중 평균 백분율 탐색 및 DI는 각각 ~50% 또는 0이어야 합니다. 인코딩 평가판에서 두 개체에 대해 [평균 ±(2× SD)보다 높은 선호도를 보이는 모든 쥐는 각 시험의 분석에서 제외되어야 한다. 이를 통해 테스트 평가판에서 환경 설정을 안정적인 개체 위치의 메모리로 안정적으로 해석할 수 있습니다. 이 값은 개별 테스트 또는 여러 테스트에서 데이터를 결합한 데이터를 계산할 수 있습니다. - 실험 설정에 가장 적합한 방법으로 데이터를 분석합니다. 기회 수준 이상의 중요한 기본 설정을 감지하기 위해 원 샘플 t-테스트를사용합니다.
- 두 개 이상의 컨텍스트를 카운터밸런싱과 사용하는 동안 컨텍스트 간에 동일한 실험 조건의 결과를 결합합니다.
참고: 동일한 쥐로 구성된 그룹이 생성되어 두 그룹에 대해 쌍t-테스트를사용하여 주제 내 비교를 가능하게 하고 두 개 이상의 그룹에 대한 분산(ANOVA)의 반복적인 측정 해석을 사용합니다.
(1)
Representative Results
여기에 는 남성 티로신 하이드록실라제(Th)-Cre 트랜스제닉랫트(13)를 사용하여 리스터 후드 균주와 야생형 리스터 후드 쥐에 4번 을 교차하는 것으로 기술된 강력하고 약한 인코딩 프로토콜모두에 대한 대표적인 결과가 나와 있다. Th-Cre 형질전환 쥐는 이 쥐 라인이 광유전학을 관련시키는 미래 연구 결과에서 사용될 것이기 때문에 이용되었습니다. 각 프로토콜을 사용하여 메모리는 1 시간 및 24 h의 지연으로 테스트되었습니다. 1 h에서 테스트 단기 메모리를 보여 주며 24-h 테스트는 장기 기억을 보여줍니다. 인코딩 기본설정에 대한 제외값은 프로토콜에 설명된 바와 같이 5개의 테스트(강력하고 약한 인코딩 프로토콜)의 결합된 데이터를 [50.8% ±(2×10.8%)로 계산하였다. 이러한 값 의 위와 아래에 인코딩 선호도가 있는 쥐는 각 테스트의 분석에서 제외되었습니다.
강력한 인코딩 실험을 위해 16마리의 쥐가 사용되었고 약한 인코딩 실험을 위해 19마리의 쥐가 사용되었습니다. 강한 인코딩 시험 동안 (3 × 5 분 인코딩; 도 4A),어느 개체(52.0 ± 1.9%, n = 16, t15 = 1.1, p = 0.29; 원샘플 t-테스트대 확률 수준)에 대한 중요한 선호도가 없었다. 이 강력한 인코딩 프로토콜은 1-h 및 24-h 지연(1-h 메모리, 77.9 ± 2.4%, n = 8, t7 = 11.8, p < 0.001; 24-h 메모리, 24-h 메모리 모두 테스트에서 기회 수준(50%)보다 훨씬 높은 평균 백분율 탐색 측면에서 볼 때 와 같이 새로운 위치에서 개체에 대한 선호도를 주도했습니다. 65.2 ± 5.3%, n = 8, t7 = 2.8, p = 0.025; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준). 1-h와 24h 메모리 사이에는 큰 차이가 없었습니다(p = 0.056; 페어링되지 않은 Welch의 t-test).
약한 인코딩 시험 중(20분 인코딩; 결과 4개의 컨텍스트에서 풀로 드린 경우; 도 4B),어느 개체(51.1 ± 1.0%, n = 66, t65 = 1.2, p = 0.24; 원샘플 t-테스트대 확률 수준)에 대한 선호도가 크게 나타났습니다. 이 약한 인코딩 프로토콜은 1-h 지연을 가진 시험에서 기회 수준에 비해 새로운 위치에서 개체에 대한 선호도가 크게 증가했지만 24-h 지연(네 가지 컨텍스트에서 결합된 데이터; 1-h 메모리, 66.7 ± 2.0%, n = 32, t31 = 8.2, p < 0.001; 24-h 메모리, 24-h 메모리, 24-h 메모리 49.6 ± 2.6%, n = 34, t33 = 0.16, p = 0.87; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준). 1-h 및 24-h 지연(1h 메모리: n = 32, 24h 메모리: n = 34, t61.5 = 5.2, p < 0.001; 페어링되지 않은 Welch의 t-test)를 가진 테스트의 성능 사이에 는 상당한 차이가 있었습니다.
그룹 레벨의 메모리는 24-h 지연 테스트에서 기회 수준 성능에 의해 인덱싱된 것으로 관찰되지 않았지만 개별적인 변형을 보였다. 노 메모리 조건에 약한 이러한 높은 변이(예를 들어,24-h 테스트)는 일반적으로 개체의 더 무작위 탐사로 인해 관찰되었다. 따라서 쥐의 성능을 개별적으로 해석하지 않는 것이 중요합니다. 대신 개별 데이터 포인트의 분포를 테스트의 신뢰할 수 있는 결과로 그룹 평균과 함께 사용할 수 있습니다. 인코딩이 강할수록 쥐의 동작이 균일해지고, 강력한 인코딩 프로토콜에 대해 도 4A에서 관찰될 수 있는 통계적 유의에 도달하는 데 필요한 쥐의 수가 줄어듭니다. 대조적으로, 약한 조건에 대한 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 더 큰 그룹이 필요합니다(그림 4B).
그림 4: 강력하고 약한 인코딩 후 메모리 성능. (A)강한 인코딩 시험 (3 × 5 분 인코딩) 1-h 또는 24 h 테스트 시험 다음에. 인코딩 시험(n = 16)동안 두 개체에 대한 중요한 선호는 없었습니다. 강력한 인코딩은 확률 수준(1-h 및 24-h 메모리: 각 그룹에서 n = 8)에 비해 1h 및 24-h 지연으로 테스트에서 새겨진 위치에서 개체에 대한 선호도가 크게 증가했습니다. 그룹 간에 는 큰 차이가 없었습니다. (B)약한 인코딩 시험(20분 인코딩)이 1h 또는 24h 시험 시험다음에 그 뒤를 따랐다. 인코딩 시험(n = 66)을 코딩하는 동안 두 개체에 대해 크게 선호하지 않았습니다. 약한 인코딩은 1-h로 시험에서 새겨진 위치에서 개체에 대한 선호도가 크게 증가했지만 기회 수준(1-h 메모리: n = 32; 24h 메모리: n = 34h 메모리: n = 34)에 비해 24-h 지연이 발생했습니다. 1-h와 24-h 지연을 가진 테스트의 성능 사이에는 상당한 차이가 있었습니다. 결과는 네 가지 컨텍스트에서 풀로 나아졌습니다. 개별 데이터 포인트는 점으로 표시됩니다. 모든 막대는 SEM± 0.05, *< p < 0.001로 새겨진 위치에서 개체탐색 비율을 표시합니다. 원 샘플 t-테스트대 확률 수준(50%, 대시 선). ###p < 0.001; ns, 중요하지; 페어링되지 않은 웰치의 t-test. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 확립된 프로토콜의 유의한 장점은 쥐의 동일한 코호트를 가진 4개의 별개의 문맥(도1C)을사용하여 4회 수행될 수 있다는 것이다. 그림 5에 표시된 결과는 두 개의 실험 그룹(1-h 및 24h 메모리 그룹)과 균형을 맞추는 한 가지 가능한 방법을 보여 줍니다. 두 그룹은 두 컨텍스트(컨텍스트 1 및 2)에 비해 균형을 이루었으며, 이는 두 가지 추가 컨텍스트(컨텍스트 3 및 4)에서 반복되었습니다. 그림 5A). 4개의 컨텍스트에서 결과는 각 컨텍스트에서 기회 수준과 선호도를 비교하여 각 실험 그룹에 대한 메모리를 평가한 도 5B, D(그림 5B,D)에서개별적으로 제시되며(1-h 메모리: 컨텍스트 1, 69.9 ± 3.6%, n = 9, t8 = 5.5, p < 0.001; 컨텍스트 2, 65.6 ± 3.9%, n = 9, t8 = 4.0, p = 0.004; 컨텍스트 3, 65.2 ± 3.8%, n = 7, t6 = 4.0, p = 0.007; 컨텍스트 4, 65.3 ± 5.6%, n = 7, t6 = 2.7, p = 0.035; 24-h 메모리: 컨텍스트 1, 45.1 ± 6.4%, n = 9, t8 = 0.77, p = 0.46; 컨텍스트 2, 49.1 ± 4.9%, n = 9, t8 = 0.18, p = 0.86; 컨텍스트 3, 57.2 ± 4.1%, n = 8, t7 = 1.7, p = 0.12; 컨텍스트 4, 47.6 ± 4.7%, n = 8, t7 = 0.52, p = 0.62; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준).
컨텍스트 1, 2 및 4에서, 그룹의 주제 간 비교는 1h와 24h 메모리(1h 메모리 대 24-h 메모리: 컨텍스트 1, t12.7 = 3.4, p = 0.005; 컨텍스트 2, t15.2 = 2.6, p = 0.019; 컨텍스트 3, t13.0 = 1.4, p = 0.17; 컨텍스트 4, t12.2 = 2.4, p = 0.032; 페어링되지 않은 웰치의 t-test). 데이터의 더 나은 표현 및 주제 내 비교를 위해 두 개의 불균형 컨텍스트에서 나온 결과가 결합되었습니다(그림5C,E). 결합된 실험군은 개별적으로 확률 수준과 비교하였다(컨텍스트 1 및 2 결합: 1-h 메모리, 67.8 ± 2.6%, n = 18, t17 = 6.7, p < 0.001; 24h 메모리, 47.1 ± 3.9%, n = 18, t17 = 0.74, p=0.4; 컨텍스트 3 및 4 결합: 1-h 메모리, 65.3 ± 3.3%, n = 14, t13 = 4.7, p < 0.001; 24-h 메모리, 52.4 ± 3.2%, n = 16, t15 = 0.73, p = 0.48; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준). 이어서, 실험군은 서로 비교하였다.
두 컨텍스트 쌍에서, 주제 내 비교에 의해 밝혀진 그룹 들 사이에 상당한 차이가 있었다 (1-h 메모리 대 24-h 메모리: 컨텍스트 1 및 2 결합, t16 = 3.5, p = 0.003; 컨텍스트 3 및 4 결합, t13 = 2.4, p = 0.032; 쌍 t-테스트). 두 개의 상반된 세션에 대해 컨텍스트 1 과 4를 사용하여 약한 인코딩 프로토콜에서도 와일드 타입 리스터 후드 쥐를 사용하여 비교 가능한 결과를 얻을 수 있었습니다(데이터가 표시되지 않음). 결과의 복제력과 신뢰성은 단방향 ANOVA를 사용하여 각 데이터 집합을 비교하여 검증되었습니다. 네 가지 컨텍스트(1h 메모리: F3,28 = 0.31, p = 0.81; 24-h 메모리: F3,30 = 0.99, p = 0.41)에서 유의한 차이가 발견되지 않았다. 따라서 이 프로토콜의 지침을 따르는 경우 개체 위치 테스트를 반복의 최소 영향없이 안정적으로 반복할 수 있습니다.
그림 5: 두 개의 실험 단이 두 세션에 걸쳐 균형을 이루는 약한 인코딩 프로토콜의 결과를 제시하고 분석하는 다양한 방법. (A)두 개의 실험 그룹(1-h 및 24h 메모리 그룹)과 균형을 맞추기 위한 실험 설계(컨텍스트 1 및 2). 카운터 밸런싱은 두 개의 추가 세션(컨텍스트 3 및 4)에서 반복되었습니다. (B와 D) 각 컨텍스트와 실험 그룹의 결과는 개별적으로 기회 수준과 서로 비교되었습니다. 네 가지 컨텍스트에서, 1-h 지연을 가진 시험에서 새신 위치에서 객체에 대한 선호도가 확률 수준 [Context 1및 2: n = 9 그룹당(B);에 비해 크게 증가하였다. 컨텍스트 3 및 4: n = 그룹당 7(D)]. 24-h 지연 테스트에서 새포지티드 위치에 있는 개체에 대한 기본 설정은 우연과 다르지 않았습니다(컨텍스트 1 및 2: n = 그룹당 9; 컨텍스트 3 및 4: 그룹당 n = 8). 컨텍스트 1, 2 및 4에서 실험 그룹의 선호도 사이에는 상당한 차이가 있었지만, 주제 간 비교에 의해 밝혀진 바와 같이 컨텍스트 3은 아니었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; 원 샘플 t-테스트대 확률 수준(50%, 대시 선). #p < 0.05; ##p < 0.01; ns, 중요하지; 페어링되지 않은 웰치의 t-test. (C와 E) 결과는 두 개의 불균형 컨텍스트에서 실험 그룹을 결합한 후 제시된다[컨텍스트 1 및 2 결합, n = 그룹당 17(C); 컨텍스트 3 및 4 결합, n = 그룹당 14(E)]. 새별 위치에서 개체에 대한 선호도는 두 컨텍스트 쌍모두에서 1h를 가진 테스트에서 기회 수준에 비해 크게 증가했지만 24-h 지연은 아닙니다. 실험 그룹의 주제 내 비교는 두 컨텍스트 쌍에서 1h 및 24h 지연을 가진 시험에서 새의 위치에서 객체에 대한 선호도 사이에 상당한 차이점을 드러냈습니다. p < 0.001; 원 샘플 t-테스트대 확률 수준(50%, 대시 선). #p < 0.05, ##p < 0.01; 쌍 t-테스트. 개별 데이터 포인트는 점으로 표시됩니다. 모든 막대는 새그림의 탐색 비율을 sEM± 의미로 표시합니다.
Discussion
개체 위치 작업은 앞에서 설명한 대로 공간 메모리를 조사하기 위해 다양한 연구에서 사용할 수 있습니다. 설치의 유연성은 서로 다른 강점의 단기 및 장기 메모리를 모델링할 수 있게 해주며, 저렴한 비용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 그러나 프로토콜에 영향을 줄 수 있는 매개 변수가 많고, 이러한 매개 변수6에서다른 연구가 약간 다르기 때문에 처음으로 작업을 성공적으로 구현하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 위의 프로토콜은 이 프로세스를 통해 독자를 원활하게 안내하기 위한 것입니다. 복제성이 높은 작업의 성공적인 구현에 중요한 단계는 아래에서 논의될 것입니다.
인코딩/테스트 세션은 종종 개체 위치 실험을 실행할 때 초점이지만, 처리 및 습관 프로토콜은 결과가 방해받지 않는 자연 쥐동작(14,15)에의존하는 이러한 종류의 행동 테스트 결과에 지대한 영향을 미친다. 따라서 인코딩/테스트 세션 앞의 단계는 쥐 동작및 메모리에 영향을 미치고 결과적으로 최종 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 주의해서 설계되어야 합니다. 쥐가 실험자에 익숙해지고 작업과 같은 취급 및 습관의 좋은 수준은 자연 행동을 전시할 가능성을 증가시키는 동시에 스트레스 요인의 효과를 최소화할 것이다8. 프로토콜에 언급 된 바와 같이, 쥐 균주가 홈 시설에서 유지되는 경우 처리는 새끼의 짜기로 일찍 시작할 수 있습니다. 이전 경험 (표시 되지 않은 데이터)와 여러 이전 연구의 그에서16,17,이 조기 처리 결과 낮은 불안과 다음 달에 호기심향상.
개체 위치 작업은 쥐의 본질적인 탐사 드라이브에전적으로 의존하기 때문에 쥐가 탐구하거나 '신포빅행동'1이라고불리는 참신함에 접근하는 것을 꺼려하지 않으면 예상되는 행동이 쉽게 방해될 수 있습니다. 따라서 연구의 특정 요구에 따라 철저한 취급 및 습관 프로토콜을 포함하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 최소 요구 사항 가이드로 사용될 수 있으며, 추가 단계를 구현할 수있다(예를 들어,연구가 추후 주사를 포함하는 경우, 주사 절차 및 특정 보유 위치에 대한 습관이 요구되는 경우). 균주와 실험 쥐의 나이는 두 가지 다른 영향력있는 요소이며 최적이 아닌 결과를 피하기 위해 실험을 계획하기 전에 고려해야합니다. 상이한 쥐 균주는 다른 행동 및 기준선 불안 수준을 가질 수 있습니다18,19,20 따라서, 프로토콜에 대한 특정 조정은 사용되는 변형에 따라 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 리스터 후드 변형과 야생 형 리스터 후드 쥐에 네 번 교차 긴 에반스 변형과 Th-Cre 형 형 트랜스 제닉 쥐와 잘 작동 하도록 확인. 행동 실험에 있는 쥐를 위한 논리적으로 이상적인 시작 나이는 약 12 주20입니다,그러나 긴장 간 가변성 및 작업의 특정 요구 사항을 고려해야 합니다. 그것은 또한 연구에 대 한 관심 있는 경우 개발 쥐를 사용할 수 있습니다., 비록 프로토콜에 조정 이 필요할 수 있습니다 하 고 여기에 적용 되지 않습니다. 그러나, 주어진 된 나이에 쥐성공적으로이 작업을 수행 하는 데 필요한 인지 기능을 개발 하는 여부를 고려 하는 것이 중요 하다. 이 것을 조사하는 연구21는 출생 후 38일및 이전이 아닌 사춘기 쥐만, 성인 쥐에서 관찰된 바와 같이, 새로운 위치에서 객체에 대한 선호도에 반영된 동종 중심의 공간 기억을 보여주었다는 것을 보고했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 첫번째 인코딩/시험 세션의 시작부분에서 15-16 주 오래된 쥐를 사용하여 성공했습니다. 이전에는 동일한 강력한 인코딩 프로토콜이 23주 된 쥐를 사용할 때 적절한 수준의 습관수준에 도달하지 못해 충분한 나이에 의식하지 못하는 부정적인 결과를 낳았습니다. 이 쥐는 기회 수준과 다르게 수행하지 못했거나 실제로, 변위 된 개체 대신 안정적인 개체에 대한 선호도 측면에서 관찰 된 참신에 대한 혐오를 나타냈다 (데이터가 표시되지 않음). 이러한 결과는 처리 습관의 나이와 타이밍이 습관의 효과에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공하고 그 결과, 시험에서 불안과 신포성 행동의 관찰에 기여한다.
여기서는 개체 위치 작업에 강력하거나 약한 인코딩을 보장하는 두 개의 서로 다른 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 수립하는 동안, 단일 긴시험(예: 20분 인코딩) 동안 탐사 5-10분 후에 개체에 대한 관심이 감소하는 것으로 관찰되었고, 쥐는 결국 탐험을 중단했다. 이렇게 하면 개체 위치의 메모리가 약해집니다. 짧은 휴식기간(예: 3 x 5분 인코딩)으로 인코딩 시험을 인터로프트하는 인코딩 프로토콜은 이를 극복하고 시험 전반에 걸쳐 높은 탐색으로 이어집니다. 따라서 이러한 두 인코딩 프로토콜의 활성 탐색 시간 및 상이한 레이아웃은 메모리의 강도에 영향을 미치며, 이는 20분 인코딩 프로토콜 이후보다 3 x 5분 인코딩 후 더 강해진다. 유사한 결과는 또한 단일 예심 대 인터리브 된 예심 프로토콜을 가진 약간 다른 기간을 사용하여 달성될 수 있고, 조정은 연구 결과 및 쥐 긴장의 필요에 맞게 할 수 있습니다.
방에 외부 단서만있는 일반 흰색 열린 필드를 사용하는 프로토콜과는 달리, 여기에 제시 된 프로토콜은 서로 다른 컨텍스트와 학습 시간이 더 필요한 장미 신호가있는 경기장을 사용합니다. 따라서 인코딩 평가판 전에 프로토콜에 컨텍스트 습관 단계를 추가하는 것이 좋습니다. 이를 통해 쥐는 습관화 중에 각 컨텍스트의 공간 맵을 형성하고 다음 인코딩 시험의 지속 시간을 줄일 수 있습니다. 또한 컨텍스트 습관은 쥐가 3D 공간 큐와 같은 각 컨텍스트 내에서 가능한 산만에 습관화하여 인코딩/테스트 세션에서 개체 탐색 이외의 동작을 최소화할 수 있도록 합니다. 여러레벨(즉, 다양한 물체 위치 조합(카운터) 및 물체 변위의 방향으로 구성된 철저한 카운터밸런싱 방법의 구현으로, 경기장 구석의 광강도 및 벽 색상/패턴의 변화로 인해 상승할 수 있는 원치 않는 선호도가 최소화된다.
인코딩/테스트 세션 간의 복제가능성을 높이고 반복의 영향을 최소화하기 위해 작업을 반복할 때 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 첫째, 고유한 컨텍스트(인코딩/테스트 세션의 반복 횟수만큼)는 동일한 컨텍스트를 사용하여 반복되는 세션을 수행하여 발생할 수 있는 공간 메모리의 축적을 방지하도록 설계되어야 합니다. 이를 달성하기 위해, 다른 색상과 패턴의 교체 가능한 벽을 가진 장치가 사용되었다(도 1B,C). 벽에 걸려 있는 뚜렷한 벽과 3D 객체(예: 장난감 또는 고유한 색상과 모양의 작은 일상 용품, 프로토콜 및 그림 1C참조)는 쥐가 자신의 맥락과 관련하여 개체 위치를 학습하는 데 잠재적으로 사용하는 공간 단서와 랜드마크입니다. 테스트가 이동된 개체에 대한 기본 설정을 생성하지 못하는 경우 컨텍스트(벽 설계 및 공간 큐)의 이러한 매개 변수를 변경하는 것을 고려할 수 있습니다. 또는 직사각형 또는 원형 형 경기장을 이 프로토콜과 같이 사각형 아레나 대신 오브젝트 위치 작업에 사용할 수 있습니다. 원형 경기장은 코너와 경기장에서 자주 관찰 되는 코너 환경 설정을 제거 하기 위해 보고된다 22, 따라서, 특히 높은 불안 쥐 또는 마우스 변형을 처리할 때 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 네 개의 서로 다른 컨텍스트를 만드는 요구 사항은 사각 모양으로 가장 최적으로 작동하지만 일부 조정 후 원형 경기장을 작동시킬 수도 있습니다.
둘째, 각 인코딩/테스트 세션 사이의 간격은 쥐가 매번 동일한 수준의 이자를 유지하되 반복의 울창한 일정으로 인한 누적 학습의 위험을 피하면서 결정되어야 합니다. 일반적으로 인코딩과 테스트 시험 사이의 지연 시간의 길이를 두 배 이상 간격으로 하는 간격은 충분하며, 더 긴 간격은 두 개 이상의 반복에 더 유리합니다. 즉, 24-h 테스트 후 최소 48h 간격은 하나 또는 두 개의 반복에 충분하지만 4개의 반복에 대해 1주 간격을 사용하는 것이 좋습니다. 그림 5의 결과와 ANOVA를 사용한 비교결과에서 볼 수 있듯이 작업을 4번 성공적으로 반복할 수 있습니다. 이를 바탕으로, 확립된 프로토콜을 사용하여 최대 4개의 실험 조건의 균형을 맞출 수 있습니다. 실험 그룹의 수는 고유한 컨텍스트에서 인코딩/평가판 세션의 반복 횟수를 결정합니다. 그림 5의 결과는 두 개의 실험 그룹과 프로토콜을 사용하는 한 가지 가능한 방법을 나타냅니다. 그룹은 두 세션에서 균형을 이루고 유효성 검사를 위해 두 개의 추가 세션에서 동일한 조건이 반복되었습니다. 두 번째 역균형 세션 집합을 사용하여 새로운 조건의 균형을 맞출 수도 있습니다. 유사하게, 서너 개의 실험 조건은 각각 서너 개의 균형 잡힌 세션을 사용하여 비교될 수 있다.
이러한 경우 컨텍스트는 프로토콜에 설명된 대조적인 특성을 수용하도록 설계되어야 합니다. 불균형 설계가 장기간 지속되는 효과나 손상을 남길 수 있는 약리학적 개입과 같은 추가 조작이 사용되는 실험에 적합하지 않을 수 있다는 점은 주목할 만하다. 시험의 효과와 복제성을 유지하기 위해 실험은 그에 따라 설계되어야 합니다. 그림 5에서설명한 바와 같이 반복된 테스트의 데이터를 여러 가지 방법으로 제시하고 분석할 수 있습니다. 초기 분석의 경우, 각 컨텍스트의 실험 그룹은 하나의 샘플 t-test를사용하여 기회 수준과 개별적으로 비교하여 중요한 선호도를 결정할 수 있습니다(그림5B,D). 이렇게 하면 데이터를 빠르게 이해하는 데 도움이 될 수 있지만 그룹의 간접적인 비교만 보장합니다. 따라서 두 개 이상의 그룹을 비교하기 위해 각각 2개의 샘플 t-테스트(쌍 또는 페어링되지 않은) 또는 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석해야 합니다. 이는 단일 인코딩/테스트세션(도 4A 및 도 5B,D) 또는 두 개의(또는 그 이상) 불균형컨텍스트(그림 5C,E)로부터그룹의 주제 간 비교 형태일 수 있다. 후자의 방법은 특히 약한 메모리 조건을 다룰 때, 특히 이전에 설명한 바와 같이 동작의 임의성으로 인해 높은 분산을 초래하는 것이 좋습니다.
불균형 컨텍스트를 결합하면 그룹의 동작을 최소한의 변형으로 안정적으로 시각화하는 데 필요한 더 큰 그룹으로 연결됩니다. 불균형 세션에서 반복이 있는 프로토콜을 사용하면 동일한 통계적 전력을 가진 단일 테스트를 사용하는 데 필요한 수의 약 1/3으로 쥐 수가 감소할 것으로 예상할 수 있습니다. 일반적으로, 반균형 세션을 위한 7~15마리의 랫트(총)의 범위와 효과 크기 및 0.8보다 큰 전력을 가진 단일 세션에 대해 20~50마리의 쥐(그룹당 10~25개)의 범위에서 샘플 크기는 충분하다. 필요한 동물의 수의 감소와 이 프로토콜을 사용하여 각 동물에게서 얻은 정보의 증가는 연구를 구체화하고 연구에서 동물의 윤리적 사용의 3R 원칙을 제공합니다. 이 단계에서는 강한 기억과 동반되지 않는 무작위 쥐 행동이 확률 과 그 이상 모두에서 개별적인 강한 선호도를 초래할 수 있지만 그룹 평균은 기회와 크게 다르지 않은 선호도를 산출해야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 개별 데이터는 신중하게 해석해야 합니다. 그룹 내개별 데이터 포인트분포도 결과를 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 도 4 및 도 5에서볼 수 있듯이 메모리의 강도에 따라 분포가 변경됩니다. 전반적으로 여기에 제시된 프로토콜은 단기 및/또는 장기 공간 메모리를 모델링하기 위해 반복된 개체 위치 작업을 구현하기 위해 쉽게 따를 수 있습니다. 간단하고 유연한 교육 프로토콜과 추가 조작을 구현할 가능성은 이 작업을 인기 있는 선택으로 만듭니다. 프로토콜을 수정하면 메모리 수집, 통합 및 회수와 같은 특정 단계를 조사할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
안토니오스 아시미나스, 도로시 체, 오하라 키이치, 데이비드 베트에게 통찰력 있는 의견과 제안에 감사드립니다. 이 연구는 에라스무스 + (G.B 및 L.N.에 의해 지원되었다); 오르후스 대학교 보건대학원(K.H.에) 노보 노디스크 재단 청년 조사상 2017 (NNF17OC000026774), 룬드벡폰덴덴덴(DANDRITE-R248-2016-2518) 및 PROMEMO - 덴마크 국립연구재단(DNRF133)이 자금을 지원하는 우수센터인 메모리 단백질 센터(T.T.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
| Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
| Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
| Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
| Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
| Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
| Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |
References
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