Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس

Published: May 20, 2021 doi: 10.3791/62498
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, 2UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

ERRATUM NOTICE

Summary

تصف هذه الطريقة تنقية التدفق الخلوي ل MEP و MKp من عظام الفخذ والساق وعظام الحوض.

Abstract

خلايا نخاع العظم الضخمة هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة تضمن إنتاج الصفائح الدموية. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال megakaryopoiesis. المراحل النهائية من هذه العملية معقدة وتنطوي كلاسيكيا على السلف Megakaryocyte-Erythrocyte ثنائي القدرة (MEP) وسلفات Megakaryocyte أحادية القدرة (MKp). هذه المجموعات السكانية تسبق تشكيل الخلايا الضخمة حسنة النية ، وعلى هذا النحو ، يمكن عزلها وتوصيفها تسمح للتحليل قوية وغير متحيزة لتشكيل megakaryocyte. يقدم هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراء لجمع الخلايا الدموية من نخاع عظم الفأر ، وإثراء السلف الدموية من خلال الاستنفاد المغناطيسي وأخيرا استراتيجية فرز الخلايا التي تسفر عن مجموعات MEP و MKp شديدة النقاء. أولا، يتم جمع خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ، والساق، وأيضا قمة الحرقفي، وهو العظم الذي يحتوي على عدد كبير من السلف الدموية. استخدام عظام قمة الحرقفي يزيد بشكل كبير من إجمالي عدد الخلايا التي تم الحصول عليها لكل فأر، وبالتالي يساهم في استخدام أكثر أخلاقية للحيوانات. تم تحسين استنفاد النسب المغناطيسي باستخدام حبات مغناطيسية 450 نانومتر مما يسمح لفرز الخلايا بكفاءة عالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وأخيرا ، فإن البروتوكول يقدم وضع العلامات وgating استراتيجية لفرز اثنين من السكان السلف megakaryocyte تنقية عالية : MEP (لين--SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9خافت)وMKP (لين-- SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9مشرق ). هذه التقنية سهلة التنفيذ وتوفر ما يكفي من المواد الخلوية لأداء 1) التوصيف الجزيئي لمعرفة أعمق لهويتها وبيولوجيتها ، 2) في اختبارات التمايز المختبري ، من شأنها أن توفر فهما أفضل لآليات نضوج الخلايا العملاقة ، أو 3) في نماذج المختبر للتفاعل مع بيئتها الدقيقة.

Introduction

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة. وتقع هذه الخلايا الكبيرة متعددة الأضلاع في نخاع العظام وبالنسبة لجميع خلايا الدم فهي مشتقة من الخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. المسار الكلاسيكي لإنتاج megakaryocytes في نخاع العظام ينبع من HSC وينطوي على جيل من السلف المختلفة التي تقيد تدريجيا إمكاناتها التمايز2. أول سلف التوقيع على الالتزام النسب megakaryocytic هو Megakaryocyte-Erythrocyte السلف (MEP)، سلف ثنائي القدرة قادرة على إنتاج كل من خلايا الغدة الدرقية وmegakaryocytes3،4،5. ثم تنتج وزارة التربية والميكارسين سلف وحيد القدرة / السلائف (MKp) التي سوف تفرق إلى megakaryocyte ناضجة قادرة على إنتاج الصفائح الدموية. الآليات التي ينطوي عليها توليد هؤلاء السلف ، فضلا عن تمايزها ونضوجها في الخلايا العملاقة معقدة ومفهومة جزئيا فقط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم تجانس السكان MEP من حيث إمكانات التمايز ومستوى الالتزام الجوهري لهذه الخلايا لا تزال غير واضحة. ولفك رموز هذه العمليات، من الضروري الحصول على (أو الوصول إلى) مجموعات منقى من MEP و MKp لإجراء تحليلات جزيئية وخلايا واحدة دقيقة.

وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعات معينة من علامات سطح الخلية لتحديد السلف ملتزمة النسب megakaryocytic في الماوس6،7،8. من هذه تم ابتكار طريقة تسمح لتنقية MEP و MKp من الفئران. تم تحسين هذه الطريقة للحصول على خلايا في عدد كاف ونوعية لعدد كبير من المقايسات. مع الاعتبارات الأخلاقية في الاعتبار، ومن أجل تقليل عدد الحيوانات المشاركة في التجارب، ونحن استحثت لحصاد نخاع العظم من عظم الفخذ والساق، وأيضا من قمة الحرقفي. يحتوي هذا العظم على تردد عال وعدد من السلف الدموية ومعظم الوقت معطوب أثناء حصاد العظام الطويل. هنا هو طريقة مفصلة لجمع موثوق بها من هذه العظام.

المعيار الثاني للتحسين هو إنتاج مجموعات خلايا عالية النقاء. الفلورسنت تنشيط فرز الخلية (FACS) هو وسيلة للاختيار من أجل الحصول على السكان تنقية من الخلايا ذات الاهتمام. ومع ذلك، يتم الوصول إلى غلة منخفضة عندما يكون السكان الخلية من الفائدة نادرة جدا. ولذلك فإن إجراءات الإثراء ضرورية. في هذا البروتوكول، تم اختيار إجراء اختيار سلبي باستخدام الخرز المغناطيسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت بروتوكولات تشمل الحيوانات وفقا للجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). رقم التصريح: E67-482-10).

1. جمع العظام الماوس

  1. التضحية بالحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: تم الحصول على البيانات الواردة في هذه المخطوطة من فئران C57Bl/6 التي يتراوح عمرها بين 8 أسابيع و12 أسبوعا. قد يختلف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها وتواتر المجموعات السكانية المذكورة حسب العمر وسلالة الماوس.
  2. رش الجسم مع الإيثانول 70٪.
  3. باستخدام مقص، وجعل شق 0.5-1 سم من الجلد عمودي على العمود الفقري وتمزيق الجلد في جميع أنحاء الجسم كله. سحب أسفل الجلد من الجزء السفلي من الجسم وإزالة الجلد.
  4. ضع الحيوان على لوحة التشريح، ووجهه للأسفل. حدد موقع عظام الحوض عن طريق انزلاق أصابعك على طول العمود الفقري المكشوف من أعلى إلى أسفل. لتحديد موقع قمة الحرقفي، حدد عثرة صغيرة في المنطقة القطنية بالقرب من hindlimbs (المنطقة الأمامية من عظم الحوض). الشكل 1A، B يقدم تمثيل تخطيطي لتشريح الماوس.

Figure 1
الشكل 1: تشريح الماوس. (أ) الماوس الأشعة السينية تظهر العظام الخلفية. لاحظ المسافة بين عظم الحوض والعمود الفقري (السهم الأصفر)، حيث يجب إدخال المقص لفصل الأطراف الخلفية بشكل صحيح عن جسم الماوس (خط منقط أصفر). (ب) التمثيل التخطيطي للعظام الغنية بنخاع العظم ذات الاهتمام. يتم تصوير عظام الحوض باللون الأحمر، وعظم الفخذ باللون الأرجواني، والظنبوب باللون الأخضر. (ج) التمثيل التخطيطي لعظم الحوض الماوس. يتوافق السيليوم مع الجزء الغني بنخاع العظم الحوضي ويتم تمييزه باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. ضع المقص الموازي للعمود الفقري ضد الفقرات وعلى مقربة من نتوء قمة الحرقفي. المضي قدما لقطع العضلات على طول الجانب من العمود الفقري فوق عظم الحوض عن طريق انزلاق مقص على طول الفقرات على طول الطريق وصولا الى الذيل.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء هذا القسم الأول من العضلات باستخدام شفرة مشرط.
  2. ضع المقص الموازي للعمود الفقري وشرع في القطع بين الفقرات وقمة الحرقفية ، كما هو مبين في الخط الأصفر المنقط على الشكل 1A. تأكد من البقاء على مقربة من الفقرات قدر الإمكان. قطع العضلات المتبقية لفصل الطرف من الجسم.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك مقاومة قليلة أو معدومة.
  3. كرر على الجانب الآخر لفصل الطرف الثاني.
  4. نقل الأطراف على سطح نظيف والتخلص من بقية الجسم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  5. كشف الحوض, عظم الفخذ, وعظام الظنبوب عن طريق إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة المحيطة مع ملقط والمشرط.
  6. المضي قدما في خلع بعناية رأس الفخذ من عظم الحوض عن طريق عقد نهاية البعيدة من عظم الفخذ مع ملقط في حين تشريح بلطف العضلات حول التعبير مع المشرط. تذبذب العظام لتسهيل الخلع.
  7. كشط قبالة العضلات المتبقية من عظم الحوض وقطع مع مشرط في منتصف التجويف التي لم تعقد رأس عظم الفخذ. يتم الاحتفاظ الهيليوم كما أنها غنية في السلف الدموية في حين يتم التخلص من الجانب الثلاثي رقيقة جدا من العظام، كما هو مبين في الشكل 1C.
  8. إزالة الأنسجة المتبقية حول السيليوم مع مشرط ووضع العظام تنظيفها في برنامج تلفزيوني عقيم تكملها 2٪ مصل العجل حديثي الولادة (PBS-2٪NBCS).
  9. باستخدام مقص، وقطع القدم من الساق في الكاحل.
  10. عقد الجزء السفلي من الساق مع ملقط وكشط العضلات حتى نحو الركبة. تجاهل الشظية وقطع عبر الهضبة الظنبوبية مع مشرط. ضع الساق في برنامج تلفزيوني معقم-2٪NBCS.
  11. إزالة الأنسجة المتبقية حول عظم الفخذ مع مشرط.
  12. عقد الجانب العلوي من عظم الفخذ مع ملقط; ضع شفرة المشرط في قاعدة الرضفة. تطبيق قوة نحو الركبة موازية لعظم الفخذ حتى انفصال الرضفة. ضع عظم الفخذ في برنامج تلفزيوني معقم-2٪NBCS. إزالة الرضفة يوفر الوصول نظيفة لإدخال إبرة لمسح النخاع.

2. الاستنفاد المغناطيسي للخلايا الإيجابية النسب

  1. في خزانة تدفق صفح، نقل العظام في طبق بيتري عقيمة مليئة عقيمة PBS-2٪NBCS.
  2. مع مشرط قطع رأس عظم الفخذ.
  3. ملء حقنة 1 مل مع برنامج تلفزيوني معقمة-2٪ NBCS وإرفاق إبرة 21 G إلى منفذ.
  4. ملء أنبوب البولي بروبلين 5 مل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني عقيم-2٪NBCS.
  5. عقد عظم الفخذ مع ملقط; أدخل الإبرة برفق في الأخدود الأيسر بعد إزالة الرضفة. تطبيق دوران على الإبرة أثناء إدراج لتجنب توصيل الإبرة. تأكد من إدخال الإبرة بالكامل في العظم حتى الشارف.
  6. نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني-2٪NBCS. الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني-2٪ NBCS من الحقنة حتى العظام واضحة.
  7. إزالة الإبرة من عظم الفخذ وإدراجه في حفرة في الجانب الآخر حيث كان رأس عظم الفخذ. الاستغناء عن وتوبيخ المخزن المؤقت مرة أخرى وتجاهل العظام.
  8. لقمة الحرقفي والساق، عقد العظام مع ملقط. أدخل الإبرة برفق في الجانب المفتوح. تطبيق دوران على الإبرة أثناء إدراج لتجنب توصيل الإبرة. تأكد من إدخال الإبرة بالكامل في العظم حتى الشارف. نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني-2٪NBCS. الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني-2٪ NBCS من الحقنة حتى العظام واضحة. تجاهل العظام.
    ملاحظة: يمكن مسح العظام من ثلاثة فئران حتى في نفس الأنبوب. تجمع تعليق الخلية.
  9. تمرير تعليق الخلية المجمعة من خلال غطاء مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وضعت على أنبوب البوليسترين 5 مل معقمة.
  10. تابع عد الخلايا.
    ملاحظة: يمكن إجراء عدد الخلايا باستخدام أي مقياس للخلايا، باستخدام Trypan Blue لتقييم الجدوى، أو باستخدام أي عداد خلايا مؤتمت. فأرة واحدة عادة ما تسفر عن 105 ± 7 × 106 خلايا.
  11. خذ جانبا 100 ميكرولتر من تعليق الخلية كما نخاع العظم الكلي، إضافة 500 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني-2٪ NBCS وحفظه على الجليد لإجراء تلطيخ.
  12. بيليه تعليق تصفيتها عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
    ملاحظة: يمكن تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة تعليق بيليه في محلول التحلل الطازج (1/10في dH2O). حضانة لمدة 5 دقائق حتى يصبح تعليق واضحة وحمراء زاهية وإضافة 10 مجلدات من برنامج تلفزيوني عقيم. المضي قدما لغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني-2٪ NBCS عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. كن حذرا عند إزالة supernatant كما بيليه الخلية فضفاضة جدا. قم بإجراء غسلة ثانية باستخدام PBS-2٪ NBCS عن طريق الطرد المركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وانتقل إلى الخطوة 2.13.
  13. إعادة إنفاق بيليه الخلية في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية الطازجة مع نسبة 100 ميكرولتر لكل 1 × 107 خلايا. احتضان على الجليد لمدة 30-45 دقيقة.
جسم التخفيف
Gr-1-البيوتين 1:500
B220 البيوتين 1:500
ماك-1-البيوتين 1:500
CD3 البيوتين 1:500
CD4 البيوتين 1:500
CD5 البيوتين 1:500
CD8 البيوتين 1:500
TER119-البيوتين 1:1000
CD127 البيوتين 1:500

الجدول 1 - الجداول

  1. خذ جانبا 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب البوليسترين 5 مل معقم المسمى لين بوس كسر. إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-2٪ NBCS وحفظه على الجليد لإجراء تلطيخ.
  2. المضي قدما لغسل الخلايا مرتين مع عقيمة PBS-2٪ NBCS عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تأكد من القيام بالغسيل الأخير في أنبوب البولي بروبلين المعقم سعة 5 مل.
  3. أثناء خطوات الغسيل، قم بإعداد الخرز للنضوب المغناطيسي.
    1. Resuspend الخرز في القارورة عن طريق دوامة تماما لمدة 30 s.
    2. نقل حجم من الخرز المقابلة لاثنين من الخرز لكل خلية الهدف في أنبوب البولي بروبلين 5 مل.
    3. غسل الخرز مرتين مع برنامج تلفزيوني-2٪ NBCS عن طريق وضع الأنبوب على المغناطيس وإزالة العازلة الغسيل باستخدام ماصة باستور الزجاج العقيم.
    4. Resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من عقيمة PBS-2NBCS٪.
  4. Resuspend بيليه من الخلايا المسماة في 250 ميكرولتر من الخرز وتخلط بلطف لمدة 5 دقائق على الجليد. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني عقيم-2٪NBCS وتخلط بلطف. لا تهز الأنبوب.
  5. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقتين.
  6. المضي قدما لجمع كسر غير المغناطيسي مع ماصة باستور الزجاج العقيم وإضافته إلى 250 ميكرولتر المتبقية من الخرز المغناطيسي. ختم أنبوب مع البارافيلم.
  7. ضع الأنبوب على بكرة أنبوب لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني عقيم-2٪NBCS وتخلط بلطف. لا تهز الأنبوب.
  9. ضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقتين.
  10. المضي قدما لجمع كسر غير المغناطيسي في أنبوب البولي بروبلين 5 مل معقم المسمى لين نيغ كسر مع ماصة باستور الزجاج العقيم.
  11. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant.
  12. إعادة إنفاق الخلايا غير المغناطيسية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم-2٪ NBCS.
  13. تابع عد الخلايا.
    ملاحظة: ماوس واحد عادة ينتج 3.9 ± 1.1 × 106 خلايا. يتم عرض النسب النموذجي تلطيخ قبل وبعد الاستنفاد في الشكل 2B.

3. فرز الخلية من السلف megakaryocyte عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. خذ الأنابيب المسماة مجموع نخاع العظم، لين بوس كسر، ولين نيغ كسر.
  2. المضي قدما لتقسيم محتوى أنبوب مجموع نخاع العظم بالتساوي إلى ستة أنابيب البوليسترين 5 مل معقمة. تسمية الأنابيب مع الأرقام 1-6.
  3. المضي قدما لتسمية أنبوب لين بوس كسر مع عدد 7.
  4. المضي قدما لتقسيم محتوى أنبوب لين نيغ كسر على النحو التالي.
    1. نقل 50 ميكرولتر إلى أنبوب البوليسترين 5 مل معقمة تحتوي على 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم-2٪ NBCS. ثم، تقسيم محتواه بالتساوي إلى 3 أنابيب البوليسترين 5 مل معقمة. تسمية هذه الأنابيب مع الأرقام 8-10.
    2. المتبقية 450 μL من لين نيغ كسر تعليق الخلية يتوافق مع أنبوب مع عدد 11.
  5. إضافة الأجسام المضادة إلى الأنابيب كما هو موضح في الجدول 2.
أنبوب تسميه كوكتيل الأجسام المضادة
مجموع نخاع العظم
1 التحكم غير الملطخ
2 تحكم واحد ملطخ CD45-FITC (1/200)
3 تحكم واحد ملطخ CD45-PE (1/200)
4 تحكم واحد ملطخ TER119-APC (1/200)
5 تحكم واحد ملطخ CD45-PECy7 (1/200)
6 تحكم واحد ملطخ CD45-APC-Cy7 البيوتين (1/200)
كسر لين بوس
7 تحكم واحد ملطخ تحكم واحد ملطخ. ستريبتافيدين-APC-Cy7 (1/500)
لين نيغ كسر
8 FMO FITC التحكم ج- كيت - APC (1/200) + SCA-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + ستريبتافيدين-APC-Cy7 (1/500)
9 FMO PE التحكم CD9-FITC (1/200) + ج-عدة-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + ستريبتافيدين-APC-Cy7 (1/500)
10 FMO PECy7 التحكم CD9-FITC (1/200) + ج-عدة-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + ستريبتافيدين-APC-Cy7 (1/500)
11 أنبوب إيجابي للفرز CD9-FITC (1/200) + ج-عدة-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + ستريبتافيدين-APC-Cy7 (1/500)

الجدول 2 - الأرباح

  1. احتضان على الجليد لمدة 30-45 دقيقة في الظلام.
  2. غسل الخلايا مع عقيمة PBS-2٪ NBCS عن طريق الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 °C.
  3. إعادة إنفاق الكريات الخلية على النحو التالي.
    1. للأنابيب 1 إلى 10، resuspend بيليه في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم-2٪ NBCS تكملها مع 7AAD (2.5 ميكروغرام / مل النهائي) (PBS-7AAD).
      تنبيه: 7AAD هو فاصل الحمض النووي وبالتالي يجب التعامل مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة (قفازات).
    2. للأنبوب 11، إعادة إنفاق بيليه في برنامج تلفزيوني عقيم-7AAD في تركيز أقصى من 5 × 106 خلايا لكل مل والحد الأدنى لحجم 1 مل.
  4. إعداد اثنين من أنابيب جمع البولي بروبلين المسمى MEP و MKp التي تحتوي على 2 مل من PBS-2٪ NBCS.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تجميع الخلايا في المخزن المؤقت culture medium أو تحلل الخلية اعتمادا على التطبيق اللاحق للخلايا التي تم فرزها. لا ينصح باستخدام أنابيب البوليسترين بسبب التداخل المحتمل مع القطرات المشحونة التي تحتوي على الخلايا ذات الاهتمام.
  5. إبقاء جميع الأنابيب على الجليد في الظلام.
  6. انتقل إلى إعداد مفرز الخلية.
    1. استخدام أنابيب 1-7 لإعداد الجهد والتعويض، أنابيب 7-10 لتحديد بوابات الفرز للسكان الخلية من الفائدة وأنبوب 11 لفرز الخلايا.
  7. وتهدف الخطوات الأولى من استراتيجية النهاية إلى استبعاد الخلايا المزدوجة والخلايا الميتة من التحليل، كما هو موضح في الشكل 3. تحديد خلايا واحدة قابلة للحياة وعرض SSC مقابل لين-APC-Cy7 نقطة مؤامرة لتأكيد كفاءة استنفاد النسب. من لين- الخلايا يتم تعيين بوابة لتحديد الخلايا إيجابية لc-عدة وسلبية أو قاتمة لSCA-1 وCD16/32. يسمح رسم نقطة التعبير CD9 مقابل CD150 للخلايا المحددة بتحديد أربعة مجموعات سكانية.
    ملاحظة: خلايا MEP و MKp كلاهما موجبة ل CD150. يمكن تعريف ثلاثة مستويات من التعبير عن CD9 (neg، خافت، وعالي). MKp التعبير عن مستوى عال من CD9 وMEP التعبير CD9 على مستوى كثافة مضان وسيطة. السكان MEP يتوافق مع لين- ج كيت+ SCA-1-CD16/32-/DIM CD150+ CD9خافت والسكان MKp يتوافق مع لين- ج كيت+ SCA-1-CD16/32-/DIM CD150+ CD9مشرق. التمييز بين CD9 عالية وCD9 السكان قاتمة للخلايا الإيجابية CD150 يتم تعيين على أساس المستوى الأقصى للتعبير CD9 في السكان السلبية CD150. فأرة واحدة عادة ما تسفر عن 5.3 ± 0.6 × 103 MKp و 27.2 ± 2.4 × 103 MEP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء تحليل Phenotypic للخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و MKp عن طريق قياس التدفق الخلوي. وسمت الخلايا بأجسام مضادة مضانة مترافقة مع CD41a وCD42c، وهي علامات كلاسيكية للنساب الضخمة والصفائح الدموية. وأعرب عن كل من علامات من قبل خلايا السكان MKP في حين لم يتم الكشف عن هذه العلامات حتى الآن على سطح خلايا السكان MEP (الشكل 4Ai، 4Aii). بوليبلويدي هو السمة المميزة للخلايا العملاقة. كما تم تحليل محتوى الحمض النووي للسكان فرزها وأظهرت أن الخلايا هي في معظمها 2N للسكان MEP ونسبة صغيرة من خلايا MKp هي 4N، ولكن لا يتم الكشف عن أعلى ploidy بشكل كبير في هذه المجموعات السكانية(الشكل 4Aiii).

من أجل تأكيد هوية مجموعات الخلايا المفرزة ، تم إجراء العديد من المقايسات التفاضلية لتقييم قدرتها على التمييز نحو الأنساب الضخمة وerythroid. أولا، تم إجراء فحوصات كلونوجينيك شبه صلبة لقياس السلف الضخم النواة (CFU-MK) وسلف الإريثرويد (BFU-E). تم الكشف عن CFU-MK في كل من MEP و MKp السكان ولكن ليس في السكان الآخرين اختبار(الشكل 4B). لم يتم الكشف عن BFU-E في السكان MKp ولكن تم الكشف عنها في السكان MEP وCD150-CD9 السكان الخلاياالخافتة (الشكل 4C).

كما تم اتباع تمايز الخلايا المفرزة في الثقافة السائلة في وجود تركيز منخفض من السيتوكينات الدموية. تظهر الصور التمثيلية من المراقبة المجهرية في يومالتمايز الثالث أن MEP و MKp أنتجا خلايا عملاقة بشكل رئيسي تم تحديدها كخلايا كبيرة(الشكل 5Aiii، 5Aiv). تم تحديد الخلايا الضخمة باستخدام التعبير CD41 و CD42c وتمثل 53.9 ± 10.4٪ و 82.0 ± 2.0٪ من الخلايا المنتجة من مجموعات خلايا MEP و MKp، على التوالي (الشكل 5B). بشكل ملحوظ ، كانت حيلة الخلايا الضخمة المنتجة التي تم تحليلها باستخدام علامة الحمض النووي Hoescht 33242 ، أكبر بالنسبة للخلايا الضخمة المشتقة من سكان MKp مقارنة بسكان MEP مما يشير إلى حالة أكثرنضجا (الشكل 5C). وأخيرا، تعرضت الخلايا المنتجة من كل السكان في يوم3 rd إلى اختبار تشكيل البروبليت9. ولوحظ أن الخلايا المستمدة من مجموعة MKP هي وحدها القادرة على انبعاث الصفائح في هذه الحالة(الشكل 5D). وهذا يشير إلى مرحلة نضوج أكثر تقدما لسكان MKp. وعلاوة على ذلك، عندما يتم تمديد مدة الثقافة تصل إلى 4-5 أيام، سوف megakaryocytes ولدت من MEP أيضا تمديد proplatelets.

Figure 2
الشكل 2: الاستنفاد المغناطيسي للنسب ارتكبت (لين) الخلايا. (أ) تمثيل تخطيطي للبروتوكول استنفاد المغناطيسي. أولا، يتم تسمية خلايا نخاع العظم غير المفتورة بكوكتيل الأجسام المضادة للفأرة للفئران المقترنة بالبيوتين. ثم يتم احتضان الخلايا مع الخرز المغناطيسي المغلف Ig المضاد للفئران ثم تتعرض للنضوب المغناطيسي باستخدام مغناطيس قوي. سيحتفظ المغناطيس بكسر Lin+ المغناطيسي المسمى مقابل جدران الأنبوب ، في حين سيتم جمع الكسر غير المغناطيسي غير المغناطيسي Lin- السلبي في أنبوب جديد. (ب)يمكن تحديد النسب الخلايا الملتزمة باستخدام الفلورسنت المترافق streptavidin. تحليل نموذجي للتعبير النسب في الخلايا قبل الاستنفاد المغناطيسي (مجموع نخاع العظام) وبعد الاستنفاد المغناطيسي (لين كسر) N = 21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خلية فرز gating الاستراتيجية. (أ) اختيار الأحداث المقابلة لخلايا واحدة قابلة للحياة. (ب) اختيار السكان MEP و MKp. (i)يتم اختيار السكان لين Neg من أحداث خلية واحدة قابلة للحياة. (2)يتم بعد ذلك اختيار السلف التي تعبر عن c-kit ومع تعبير منخفض إلى لا تعبير عن مستضد Sca-1 أو CD16/32. (iii)CD9 و CD150 مستويات التعبير تعريف أربعة مجموعات الخلايا. يتم تعريف MKp CD9مشرقCD150+ الخلايا، يتم تعريف MEP CD9 CD150خافت+. ويستند الحد الأعلى للتعبير CD9 CD9خافتCD150+ السكان على مستوى التعبير CD9 الحد الأقصى للخلايا CD150- . لغرض التحليل ، CD9 CD150خافت-- الخلايا (السلف) وCD9--CD150-- (السلبية المزدوجة : DN) كما تم فرزها. (ج)تستند بوابات فرز الخلايا على ضوابط الفلورسينس ناقص واحد (FMO). (i) التحكم FMO لبوابات CD9 (ii) FMO التحكم لبوابات CD150. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف السكان الخلية MEP و MKp. (أ) تحليل تدفق قياس الخلايا من (ط) CD41 التعبير،(2)التعبير CD42c و (3) محتوى الحمض النووي (Hoechst33342) في CD9+CD150خافت (MEP) وCD9+CD150مشرق (MKp) مجموعات الخلايا. (ب)تحديد كمي ل CFU-MK من مجموعات الخلايا المفرزة. CD9-CD150- (DN)، CD9+CD150- (بروغ)، CD9+CD150خافت (MEP)، وCD9+CD150مشرق (MKp) تم فرز مجموعات الخلايا ومطلية في هلام الكولاجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. (ج)تحديد كمي ل BFU-E من مجموعات الخلايا المفرزة. CD9-CD150- (DN)، CD9+CD150- (بروغ)، CD9+CD150خافت (MEP)، وCD9+CD150مشرق (MKp) تم فرز مجموعات الخلايا ومطلية في هلام السليلوز الميثيل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إمكانية التمايز من MEP و MKP. CD9--CD150--(DN) ، CD9+CD150--(بروغ) ، CD9+CD150خافت(MEP) ، وCD9+CD150مشرق(MKp) تم استزراع مجموعات الخلايا لمدة ثلاثة أيام في StemS تكملة متوسطة مع SCF (7.5 نانوغرام / مل)، Flt-3 (5 نانوغرام / مل)، IL-6 (1 نانوغرام / مل)، وTPO (10 نانوغرام / مل). (أ)تم التقاط صور تمثيلية بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة. (ب)ثم تم تقييم النسبة المئوية للCD41+CD42c+ megakaryocytes عن طريق قياس التدفق الخلوي. N = 3. (ج)مستوى ploidy من CD41+CD42c+ megakaryocytes ثم تم تقييمها مع Hoechst عن طريق تدفق قياس الخلايا. N = 3. (D) الخلايا المنتجة في اليوم 3 من CD9-CD150-(DN)، CD9+CD150-(بروغ)، CD9+CD150خافت(MEP)، وCD9+CD150مشرق(MKP) تم حصادها populations الخلية ومثقفة في المتوسط DMEM تكملها 50 نانوغرام / مل TPO، 10 ٪ مصل العجل الجنيني، و 100 U/mL هيرودين. (1)تم تحديد نسبة الخلايا الضخمة التي تشكل الصفائح الدموية في الثقافة من خلال المراقبة المجهرية. تم تحديد الخلايا الضخمة بناء على حجمها و / أو وجود الصفائح. N = 2. (2)صورة تمثيلية لبروبليتيليت تحمل megakaryocyte بواسطة المجهر على النقيض من المرحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة في هذه الورقة يسمح لاستخراج وتنقية الماوس MEP و MKp. وكان من السمات الهامة في تحسين البروتوكول الحصول على عدد كاف من الخلايا التي من شأنها أن تكون متوافقة مع معظم المقايسات الجزيئية والخلوية. عادة ما تتكون الممارسة العامة لجمع عظام الفأر لاستخراج الخلايا المكونة للدم في حصاد كل من عظم الفخذ والساق لكل فأر. وبالتالي غالبا ما يتم تجاهل عظم الحوض ، وهو مصدر آخر للمواد الدموية. أسباب عدم جمع قمة الحرقفي هو ضعف المعرفة من التشريح الداخلي للهيكل العظمي للفأر وحقيقة أن المستخدمين يجمعون كلاسيكيا hindlimbs عن طريق قطع عبر أو فوق رأس عظم الفخذ. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يفترض أن خلايا النخاع لن يتم إخراجها من عظم قمة الحرقفي بكفاءة بسبب وجود trabeculae ، والتي هي غائبة في الجزء الأوسط من الساق وعظم الفخذ. في هذا البروتوكول، يتم معالجة هذين الشاغلين ويتم تقديم طريقة موحدة وموثوقة وفعالة من حيث الوقت تسمح بالتدفق السليم لكل عظمة من عظام الأطراف الخلفية، بما في ذلك عظم الحوض. على وجه الخصوص، واستخدام العظام الحرقفي الغلة 105 ± 7 × 106 خلايا لكل فأر في حين أن الطريقة الكلاسيكية عادة ما تسفر عن 42 ± 5 × 106 خلايا. ومن الفوائد الرئيسية لهذه الطريقة انخفاض عدد الحيوانات اللازمة للحصول على عدد معين من الخلايا المستهدفة، مما يوفر ظروفا تجريبية أكثر أخلاقية وفعالية من حيث التكلفة. ولذلك ينطبق هذا الإجراء أيضا على أي دراسة تتطلب تعليق خلايا نخاع العظم مثل عزل الخلايا الجذعية الدموية10 أو تحليل سلوك السلف الدموي في ظروف شبه صلبة11.

فرز الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي هو تقنية قوية مع ميزة كبيرة من حيث النقاء بالمقارنة مع تقنيات الإثراء المغناطيسي، ولكن العائد من فرز الخلايا للسكان النادرة يمكن أن يكون أقل مما كانت عليه بالنسبة للسكان أكثر وفرة. وبالتالي فإن الاستنفاد المغناطيسي للخلايا غير المرغوب فيها مسبقا هو طريقة مفيدة لزيادة وتيرة الخلايا ذات الاهتمام. هنا، يختلف إجراء الاستنفاد المغناطيسي عن توصية الشركة المصنعة ويأخذ في الاعتبار عدم التجانس في التعبير عن علامات السطح المستخدمة لإزالة الخلايا الإيجابية النسب غير المرغوب فيها. مع نموذجي، بروتوكولات خطوة واحدة، والخلايا الإيجابية النسب مع أعلى تعبير عن علامات السطح تشبع بسرعة الخرز المغناطيسي. وسوف تمنع التقاط اللاحقة من الخلايا المسماة المتبقية عن طريق المنافسة وعائق steric، وبالتالي الحد بشكل كبير من فعالية الاستنفاد. ولمعالجة هذه المشكلة، تم تصميم استنفاد مغناطيسي من خطوتين يسمح بالإزالة التسلسلية لجميع الخلايا الإيجابية النسب، مما يسمح باستنفاد صارم مناسب لفرز الخلايا.

معلمة هامة أخرى لتحقيق استنفاد كفاءة هي ظروف وضع العلامات المناسبة للخلايا الإيجابية النسب غير المرغوب فيها. ولذلك تم تحسين المعايرة الأجسام المضادة على وجه التحديد. استخدام تركيزات أعلى من الأجسام المضادة سيؤدي إلى الإفراط في rosetting من الخرز المغناطيسي واستنزاف غير محددة من الخلايا السلبية النسب من الفائدة. استخدام MEP تنقية عالية والسكان الخلية MKP هو أداة هامة في دراسة megakaryopoiesis. من أجل توضيح الآليات التي تتحكم في هذه العملية ، حققت الدراسة في دور البيئة الدقيقة الخلوية وأظهرت أن مجموعة خلايا الكبد الجنينية سترومال ستدعم تمايز MKp10. ويمكن أيضا استخدام السكان المفرزين للتحليلات الجزيئية أو الفردية القائمة على الخلايا. وسيكون هذا ذات صلة خاصة بالنظر إلى المفهوم الناشئ عن خلية النحل الضخمة المتحيزة HSC12،13،14. إنتاج megakaryocyte مباشرة من السكان HSC دون توليد سلف ثنائي القدرة سيكون مسار الطوارئ استجابة للإجهاد13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا مونيك فرويند وكاثرين زيسيل وكيتي على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة العامة لمناهضة الانتخابات ومنظمة أطباء بلا حدود، وغرانت ANR-17-CE14-0001-01 إلى Henri.de la. سال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21-gauge needles BD Microlance 301155
7AAD Sigma-Aldrich A9400
Antibody Gr-1-biotin eBioscience 13-5931-85 Magnetic depletion
Antibody B220-biotin eBioscience 13-0452-85 Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotin eBioscience 13-0112-85 Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotin eBioscience 13-0031-85 Magnetic depletion
Antibody CD4-biotin eBioscience 13-9766-82 Magnetic depletion
Antibody CD5-biotin eBioscience 13-0051-85 Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotin eBioscience 13-0081-85 Magnetic depletion
Antibody TER119-biotin eBioscience 13-5921-85 Magnetic depletion
Antibody CD127-biotin eBioscience 13-1271-85 Magnetic depletion
Antibody CD45-FITC eBioscience 11-0451-85 Cell sorting
Antibody CD45-PE eBioscience 12-0451-83 Cell sorting
Antibody TER119-APC eBioscience 17-5921-83 Cell sorting
Antibody CD45-PECy7 eBioscience 25-0451-82 Cell sorting
Antibody CD45-biotin eBioscience 13-0451-85 Cell sorting
Antibody CD9-FITC eBioscience 11-0091-82 Cell sorting
Antibody  c-kit-APC eBioscience 17-1171-83 Cell sorting
Antibody Sca-1-PE eBioscience 12-5981-83 Cell sorting
Antibody CD16/32-PE eBioscience 12-0161-83 Cell sorting
Antibody CD150-PECy7 eBioscience 25-1502-82 Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEM Stemcell technologies #09650
Dissection pad Fisher Scientific 10452395
DPBS Life Technologies 14190-094
Ethanol vWR Chemicals 83813.360
Forceps Euronexia P-120-AS
Glass pasteur pipette Dutscher 42011
Magnet :  DynaMag-5 Thermo Fisher Scientific 12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Thermo Fisher Scientific 11035
Megacult Stemcell technologies #04970
MethoCult SF M3436 Stemcell technologies #03436
Newborn Calf Serum Dutscher 50750-500
Red Cell Lysis solution BD Bioscience 555899
Scalpels Fisher Scientific 12308009
Scissors Euronexia C-165-ASB
Sterile 1 mL syringes BD Bioscience 303172
Sterile 15mL tubes Sarstedt 62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubes Falcon 352063
Sterile 5mL polystyrene tubes Falcon 352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer cap Falcon 352235
Sterile petri dish Falcon 353003
Streptavidin-APC-Cy7 BD Biosciences 554063 Cell sorting
Tube roller Benchmark Scientific R3005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
  3. Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
  4. Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
  5. Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
  6. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  7. Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
  8. Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
  9. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  10. Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
  11. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
  12. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  13. Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
  14. Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).

Tags

علم الأحياء، العدد 171،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 07/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet,… More

Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. J. Vis. Exp. (171), e62498, doi:10.3791/62498 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter