In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo
Summary
Descriviamo qui il metodo per l’imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell’osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.
Abstract
Le piastrine sono prodotte da megacariociti, cellule specializzate situate nel midollo osseo. La possibilità di immagine dei megacariociti in tempo reale e del loro ambiente nativo è stata descritta più di 10 anni fa e getta nuova luce sul processo di formazione delle piastrine. I megacariociti estendono protrusioni allungate, chiamate proplatelet, attraverso il rivestimento endoteliale dei vasi sinusoidi. Questo documento presenta un protocollo per l’immagine simultanea in tempo reale di megacariociti marcati fluorescenti nel midollo osseo del cranio e nei vasi sinusoidi. Questa tecnica si basa su un intervento chirurgico minore che mantiene intatto il cranio per limitare le reazioni infiammatorie. La testa del topo è immobilizzata con un anello incollato al cranio per impedire ai movimenti di respirare.
Utilizzando la microscopia a due fotoni, i megacariociti possono essere visualizzati per un massimo di poche ore, consentendo l’osservazione di protrusioni cellulari e proplatelet nel processo di allungamento all’interno di vasi sinusoidi. Ciò consente la quantificazione di diversi parametri relativi alla morfologia delle sporgenze (larghezza, lunghezza, presenza di aree di costrizione) e al loro comportamento di allungamento (velocità, regolarità o presenza di pause o fasi di retrazione). Questa tecnica consente anche la registrazione simultanea delle piastrine circolanti nei vasi sinusoidi per determinare la velocità piastrinica e la direzione del flusso sanguigno. Questo metodo è particolarmente utile per studiare il ruolo dei geni di interesse nella formazione piastrinica utilizzando topi geneticamente modificati ed è anche suscettibile di test farmacologici (studiare i meccanismi, valutare i farmaci nel trattamento dei disturbi della produzione piastrinica). È diventato uno strumento inestimabile, soprattutto per integrare gli studi in vitro poiché è ormai noto che la formazione di proplatelet in vivo e in vitro si basa su meccanismi diversi. È stato dimostrato, ad esempio, che i microtubuli in vitro sono necessari per l’allungamento del proplatelet di per sé. Tuttavia, in vivo, servono piuttosto come un’impalcatura, l’allungamento è principalmente promosso dalle forze del flusso sanguigno.
Introduction
Le piastrine sono prodotte da cellule specializzate in megacariociti situate nel midollo osseo. Il modo preciso in cui i megacariociti rilasciano piastrine nella circolazione è rimasto a lungo poco chiaro a causa della sfida tecnica nell’osservare eventi in tempo reale attraverso l’osso. La microscopia a due fotoni ha contribuito a superare questa sfida e ha portato a importanti progressi nella comprensione del processo di formazione delle piastrine. Le prime osservazioni in vivo di megacariociti sono state fatte da von Andrian e colleghi nel 2007, con la visualizzazione di megacariociti fluorescenti attraverso il cranio1. Ciò è stato possibile perché lo strato osseo nel cranio frontoparietale di topi giovani adulti ha uno spessore di poche decine di micron ed è sufficientemente trasparente da consentire la visualizzazione di cellule fluorescenti nel midollo osseo sottostante2.
Gli studi successivi hanno applicato questa procedura per valutare la formazione di proplatelet in varie condizioni e per decifrare i meccanismi sottostanti3,4,5,6. Questi studi hanno fornito la prova definitiva che i megacariociti estendono dinamicamente le protrusioni, chiamate proplatelet, attraverso la barriera endoteliale dei vasi sinusoidi (Figura 1). Questi propulati vengono poi rilasciati come lunghi frammenti che rappresentano diverse centinaia di piastrine in volume. Le piastrine si formeranno dopo il rimodellamento delle proplatelet nella microcircolazione degli organi a valle, in particolare nei polmoni7. Ad oggi, tuttavia, il processo preciso e i meccanismi molecolari rimangono oggetto di dibattito. Ad esempio, il ruolo proposto delle proteine citoscheletriche nell’allungamento delle proplatelet differisce tra le condizioni in vitro e in vivo 3e le differenze nella formazione dei proplatelet sono state dimostrate in condizioni infiammatorie6. A complicare ulteriormente le cose, un recente studio ha contestato il concetto guidato dai proplatelet e ha proposto che in vivo,le piastrine si formino essenzialmente attraverso un meccanismo di gemmazione della membrana a livello di megacariociti8.
Questo documento presenta un protocollo per l’osservazione di megacariociti e proplatelet nel midollo osseo dall’osso del cranio in topi viventi, utilizzando una procedura minimamente invasiva. Approcci simili sono stati precedentemente descritti per visualizzare altre cellule del midollo, in particolare cellule staminali ematopoietiche e progenitrici9. L’attenzione qui è sull’osservazione di megacariociti e piastrine per dettagliare alcuni parametri che possono essere misurati, in particolare le morfologie delle proplatelet e la velocità piastrinica. Questo protocollo presenta come inserire un catetere nella vena giugulare per iniettare traccianti fluorescenti e farmaci e osservare attraverso l’osso del cranio. L’osso calvarioriale viene esposto con un intervento chirurgico minore in modo che un anello sia incollato all’osso. Questo anello serve a immobilizzare la testa e prevenire i movimenti dovuti alla respirazione e formare una tazza piena di soluzione salina come mezzo di immersione della lente. Questa tecnica ben si presta a i) osservare in tempo reale la geometria sinusoide e i megacariociti che interagiscono con la parete del vaso; ii) seguire i megacariociti nel processo di formazione, allungamento e rilascio delle proplatelet; e iii) misurare i movimenti piastrinici per monitorare il flusso sanguigno sinusoide complesso. I dati ottenuti utilizzando questo protocollo sono stati recentemente pubblicati3.
Protocol
Representative Results
Discussion
I meccanismi di formazione delle piastrine dipendono fortemente dall’ambiente del midollo osseo. Quindi, la microscopia intravitale è diventata uno strumento importante sul campo per visualizzare il processo in tempo reale. I topi con megacariociti fluorescenti possono essere ottenuti incrociando topi che esprimono la cre ricombinatasi in megacariociti con qualsiasi topo reporter floxed contenente una cassetta di espressione genica fluorescente condizionale. Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG (B6.129 (Cg) -<em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Austria) per la sua consulenza esperta sugli esperimenti di microscopia a due fotoni nel momento in cui abbiamo stabilito la tecnica in laboratorio, e Yves Lutz presso l’Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Francia) per la sua esperienza e l’aiuto con il microscopio a due fotoni. Ringraziamo anche Jean-Yves Rinkel per il suo aiuto tecnico e Ines Guinard per il disegno dello schema in Figura 1. Ringraziamo ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) per il suo supporto nell’acquisizione del microscopio a due fotoni. AB è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato dell’Etablissement Français du Sang (APR2016) e dell’Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Referências
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
