인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상
Summary
우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
혈소판은 골수에 위치한 특수 세포인 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 10년 이상 전에 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화할 수 있는 가능성과 그들의 토착 환경은 혈소판 형성 과정에 새로운 빛을 비추고 있습니다. 메가카요세포는 부비동성 혈관의 내피 안대기를 통해 프로플라틀레라고 불리는 길쭉한 돌출부를 확장합니다. 이 논문은 두개골 골수와 부비동성 용기에 형광으로 표기된 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 염증 반응을 제한하기 위해 두개골을 그대로 유지하는 사소한 수술에 의존합니다. 마우스 헤드는 호흡의 움직임을 방지하기 위해 두개골에 붙어 링으로 고정됩니다.
2광자 현미경을 사용하여 거대 카르요세포는 최대 몇 시간 동안 시각화할 수 있으므로 부비동성 혈관 내부의 신장 과정에서 세포 돌출 및 프로플라츠를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 돌출의 형태(너비, 길이, 수축 영역의 존재)와 그들의 신장 동작(속도, 규칙성 또는 일시 정지 또는 후퇴 단계의 존재)과 관련된 여러 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 또한 혈소판 속도 및 혈류 방향을 결정하기 위해 부비동성 용기에서 순환 혈소판의 동시 기록을 허용합니다. 이 방법은 유전자 변형 마우스를 사용하여 혈소판 형성에 대한 관심있는 유전자의 역할을 연구하는 데 특히 유용하며 약리학적 테스트 (메커니즘을 연구하고 혈소판 생산 장애의 치료에 있는 약물을 평가). 그것은 매우 귀중 한 도구가 되었다, 그것은 지금 생체 내 및 체 외 프로 플라틀릿 형성 다른 메커니즘에 의존 알려져 있다 으로 체 외 연구를 보완 하기 위해. 예를 들어, 시험관 내 마이크로투부레는 연막 연도에 필요하다는 것이 나타났다. 그러나, 생체 내에서,그들은 오히려 비계 역할을, 신장은 주로 혈류력에 의해 추진되고.
Introduction
혈소판은 골수에 위치한 메가카요세포 전문 세포에 의해 생성된다. 메가카요세포가 혈소판을 순환에서 방출하는 정확한 방법은 뼈를 통해 실시간 이벤트를 관찰하는 기술적 도전으로 인해 오랫동안 불분명하게 남아 있습니다. 2광자 현미경 검사는 이 도전을 극복하는 것을 도왔고 혈소판 형성 과정을 이해하는 중요한 발전으로 이끌어 냈습니다. 생체 내 첫 번째 생체 내 메가카요세포 관측은 2007년 폰 안드리안과 동료들이 두개골1을통해 형광 메가카요사이클을 시각화하여 만들어졌다. 이는 젊은 성인 마우스의 전두엽 두개골에 있는 뼈 층이 수십 개의 미크론의 두께를 가지고 있고 근본적인 골수2에서형광 세포의 시각화를 허용하기에 충분히 투명하기 때문에 가능하였다.
후속 연구는 다양한 조건하에서 프로플라틀 형성을 평가하고 기본메커니즘을해독하기 위해이 절차를 적용3,4,5,6. 이러한 연구는 거대 카르요세포가 부비동성 혈관의 내피 장벽을 통해 프로플라틀레라고 불리는 돌출부를 동적으로 확장한다는 확실한 증거를제공했다(도 1). 이 프로플라슬은 그 때 부피에 있는 수백개의 혈소판을 나타내는 긴 조각으로 풀어 놓입니다. 혈소판은 다운스트림 장기의 미세 순환, 특히 폐7에서프로플라톤의 리모델링 후 형성될 것이다. 현재까지, 그러나, 정확한 프로세스 및 분자 기계장치는 논쟁의 대상이 남아 있습니다. 예를 들어, 프로플라슬의 신장에서 세포골격 단백질의 제안된 역할은 시험관 내 및 생체 내조건(3)사이에 다르며, 프로플라츠톤 형성의 차이는 염증조건6하에서입증되었다. 더 복잡한 것, 최근 연구는 프로 플라츠판 구동 개념에 이의를 제기하고 생체 내에서,혈소판은 본질적으로 메가 카요세포 수준8에서막 신진 메커니즘을 통해 형성된다는 것을 제안했다.
이 논문은 최소한의 침습 적 절차를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈에서 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet의 관찰을 위한 프로토콜을 제시합니다. 유사한 접근법은 이전에 다른 골수 세포, 특히 조혈 줄기 및 선조 세포9를시각화하기 위해 설명되었습니다. 여기서 초점은 측정 할 수있는 몇 가지 매개 변수를 자세히 메가 karyocytes 및 혈소판의 관찰에, 특히 proplatelet 형태와 혈소판 속도. 이 프로토콜은 형광 추적자와 약물을 주입하고 두개골 뼈를 통해 관찰하기 위해 경정맥에 카테터를 삽입하는 방법을 제시합니다. 칼변종 뼈는 반지가 뼈에 붙어 있도록 경미한 수술을 사용하여 노출됩니다. 이 링은 머리를 고정하고 호흡으로 인한 움직임을 방지하고 렌즈의 침수 매체로서 식염수로 채워진 컵을 형성하는 역할을합니다. 이 기술은 i) 용기 벽과 상호 작용하는 부비동 형상 및 거대 카르요세포가 실시간으로 관찰하는 데 적합합니다. ii) 프로플라츠 형성, 신장 및 방출 과정에서 메가카요세포체를 따릅니다. 및 iii) 혈소판 움직임을 측정하여 복잡한 부비동성 혈류를 모니터링합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 최근에3로게시되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈소판 형성의 메커니즘은 골수 환경에 크게 의존한다. 따라서, 인트라바이탈 현미경 검사는 실시간으로 프로세스를 시각화하는 분야에서 중요한 도구가되었습니다. 형광 메가카요세포가 있는 마우스는 조건부 형광 유전자 발현 카세트를 함유하는 어떤 플로스기자 마우스와 함께 메가카요사이클로 Cre 재조합을 발현하는 마우스를 교차시킴으로써 얻을 수 있다. 여기서, mTmG 기자 마우스는 (B6.129(…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 우리가 실험실에서 기술을 설립 할 때 두 광자 현미경 실험에 대한 자신의 전문가 조언에 대한 플로리안 게르트너 (과학 기술 오스트리아, 클로스터뉴부르크, 오스트리아) 플로리안 게르트너 (과학 기술 오스트리아, 오스트리아)에 감사하고 싶습니다, 이미징 센터 IGBMC /CBI (일키르치, 프랑스)에서 이브 루츠 자신의 전문 지식과 두 개의 사진 현미경에 대한 도움. 우리는 또한 그의 기술적 인 도움에 대한 장 이브 린셀과 그림 1에서 스키마의 그림에 대한 이네스 기나드 감사합니다. 우리는 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)의 두 광자 현미경 의 인수에 대한 지원에 감사드립니다. AB는 에타블리스 프랑수아 뒤 상 (APR2016)과 기관 내셔널 드 라 레체체 (ANR-18-CE14-0037-01)에서 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Referências
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