In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici
Summary
Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l’angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.
Abstract
I recenti progressi nelle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e nelle tecnologie di modifica genetica consentono lo sviluppo di nuovi modelli di malattia basati su cellule umane per programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD). Sebbene questi nuovi dispositivi possano prevedere la sicurezza e l’efficacia dei farmaci sperimentali negli esseri umani in modo più accurato, il loro sviluppo in clinica dipende ancora fortemente dai dati dei mammiferi, in particolare l’uso di modelli di malattia murina. Parallelamente ai modelli di malattia organoide umana o organo-on-chip, lo sviluppo di pertinenti modelli murini in vitro è quindi un’esigenza insoddisfatta per valutare l’efficacia diretta dei farmaci e i confronti di sicurezza tra specie e condizioni in vivo e in vitro . Qui viene descritto un saggio di germinazione vascolare che utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi (EB). Gli EB vascolarizzati coltivati su gel di collagene 3D sviluppano nuovi vasi sanguigni che si espandono, un processo chiamato angiogenesi che germoglia. Questo modello riassume le caratteristiche chiave dell’angiogenesi in vivo che germoglia la formazione dei vasi sanguigni da una rete vascolare preesistente, compresa la selezione delle cellule della punta endoteliale, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida cellulare, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. È suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l’angiogenesi e mostra somiglianze con saggi vascolari tridimensionali (3D) recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane.
Introduction
Negli ultimi tre decenni, la scoperta di farmaci basata sul bersaglio (TDD) è stata ampiamente utilizzata nella scoperta di farmaci dall’industria farmaceutica. TDD incorpora un bersaglio molecolare definito che svolge un ruolo importante in una malattia e si basa sullo sviluppo di sistemi di coltura cellulare relativamente semplici e letture per lo screening dei farmaci1. La maggior parte dei modelli di malattia tipici utilizzati nei programmi TDD includono metodi tradizionali di coltura cellulare come cellule tumorali o linee cellulari immortalizzate coltivate all’interno di ambienti artificiali e substrati non fisiologici. Sebbene molti di questi modelli abbiano fornito strumenti validi per identificare farmaci candidati di successo, l’uso di tali sistemi può essere discutibile a causa della loro scarsa rilevanza per la malattia2.
Per la maggior parte delle malattie, i meccanismi sottostanti sono infatti complessi e vari tipi di cellule, vie di segnalazione indipendenti e più set di geni sono spesso trovati per contribuire a uno specifico fenotipo di malattia. Questo vale anche per le malattie ereditarie in cui la causa primaria è una mutazione in un singolo gene. Con il recente avvento delle tecnologie delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e degli strumenti di modifica genetica, è ora possibile generare organoidi 3D e modelli di malattia organ-on-chip che potrebbero ricapitolare meglio la complessità umana in vivo 3,4. Lo sviluppo di tali tecnologie è associato a una rinascita dell’interesse per i programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD)1. La PDD può essere paragonata allo screening empirico, in quanto non si basano sulla conoscenza dell’identità di uno specifico bersaglio farmacologico o su un’ipotesi sul suo ruolo nella malattia. L’approccio PDD è ora sempre più riconosciuto per contribuire fortemente alla scoperta di farmaci di prima classe5. Poiché lo sviluppo delle tecnologie organoidi umane e organ-on-chip è ancora agli inizi, si prevede che i modelli iPSC (integrati con strumenti innovativi di imaging e apprendimento automatico6,7) forniranno, nel prossimo futuro, molteplici nuovi modelli di malattia basati su cellule complesse per lo screening dei farmaci e i programmi PDD associati per superare la scarsa produttività dell’approccio TDD8, 9.
Mentre i modelli organoidi umani e organ-on-chip possono fornire importanti informazioni sulla complessità della malattia e sull’identificazione di nuovi farmaci, portare i farmaci nella nuova pratica clinica si basa fortemente anche sui dati provenienti da modelli animali per valutarne l’efficacia e la sicurezza. Tra questi, i topi geneticamente modificati sono sicuramente i modelli di mammiferi più preferiti. Hanno molti vantaggi in quanto hanno un tempo di generazione relativamente breve per i mammiferi, hanno molti fenotipi simili alle malattie umane e possono essere facilmente manipolati geneticamente. Sono quindi ampiamente utilizzati nei programmi di scoperta di farmaci10. Tuttavia, colmare il divario tra topi e umani rimane una sfida importante11. Lo sviluppo di modelli murini in vitro equivalenti agli organoidi umani e ai modelli organo-on-chip potrebbe colmare almeno parzialmente questa lacuna, in quanto consentirà confronti diretti dell’efficacia e della sicurezza dei farmaci tra i dati in vivo sul topo e quelli umani in vitro .
Qui viene descritto un test di germinazione vascolare nei corpi embrioidi di topo (EB). I vasi sanguigni sono composti da cellule endoteliali (rivestimento interno delle pareti dei vasi), cellule murali (cellule muscolari lisce vascolari e periciti)12. Questo protocollo si basa sulla differenziazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC) in EB vascolarizzati utilizzando goccioline sospese che ricapitolano de novo la cellula endoteliale e la differenziazione delle cellule murali13,14. Le ESC di topo possono essere facilmente stabilite in coltura da blastocisti isolate di topo al giorno 3.5 con background genetico diverso15. Forniscono anche possibilità per l’analisi clonale, il tracciamento del lignaggio e possono essere facilmente manipolati geneticamente per generare modelli di malattia13,16.
Poiché i vasi sanguigni nutrono tutti gli organi, non sorprende che molte malattie, se non tutte, siano associate a cambiamenti nella microvascolarizzazione. In condizioni patologiche, le cellule endoteliali possono adottare uno stato attivato o possono diventare disfunzionali con conseguente morte delle cellule murali o migrazione lontano dai vasi sanguigni. Questi possono provocare un’eccessiva angiogenesi o rarefazione dei vasi, possono indurre un flusso sanguigno anormale e una barriera dei vasi sanguigni difettosa che porta a stravaso delle cellule immunitarie e infiammazione12,17,18,19. La ricerca per lo sviluppo di farmaci che modulano i vasi sanguigni è, quindi, elevata, e sono già stati identificati molteplici attori e concetti molecolari per il targeting terapeutico. In questo contesto, il protocollo descritto è particolarmente adatto per la costruzione di modelli di malattia e per test farmacologici in quanto riassume le caratteristiche chiave dell’angiogenesi in vivo che germoglia, tra cui la selezione delle cellule endoteliali della punta e del peduncolo, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida delle cellule endoteliali, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. Mostra anche somiglianze con saggi vascolari 3D recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un test imparziale, robusto e riproducibile basato sulla germinazione vascolare 3D basato su EB che è suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l’angiogenesi. Questo metodo offre vantaggi rispetto a molti saggi bidimensionali (2D) ampiamente utilizzati che utilizzano colture di cellule endoteliali come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) per monitorare la migrazione (test di graffio laterale o il saggio della camera di Boyden)22,23 o proliferazione (conte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, e dall’Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
Referências
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