In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos
Summary
Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.
Abstract
Los avances recientes en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y tecnologías de edición de genes permiten el desarrollo de nuevos modelos de enfermedades basadas en células humanas para programas de descubrimiento fenotípico de fármacos (PDD). Aunque estos nuevos dispositivos podrían predecir la seguridad y eficacia de los medicamentos en investigación en humanos con mayor precisión, su desarrollo a la clínica todavía depende en gran medida de los datos de mamíferos, especialmente el uso de modelos de enfermedades de ratón. Paralelamente a los modelos de enfermedades organoides u órganos en chip humanos, el desarrollo de modelos relevantes de ratón in vitro es, por lo tanto, una necesidad insatisfecha para evaluar la eficacia directa de los medicamentos y las comparaciones de seguridad entre especies y las condiciones in vivo e in vitro . Aquí, se describe un ensayo de germinación vascular que utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides (EB). Los EB vascularizados cultivados en gel de colágeno 3D desarrollan nuevos vasos sanguíneos que se expanden, un proceso llamado angiogénesis germinada. Este modelo recapitula las características clave de la angiogénesis germinada in vivo , la formación de vasos sanguíneos a partir de una red vascular preexistente, incluida la selección de células de la punta endotelial, la migración y proliferación de células endoteliales, la guía celular, la formación de tubos y el reclutamiento de células murales. Es susceptible de detección de fármacos y genes que modulan la angiogénesis y muestra similitudes con los ensayos vasculares tridimensionales (3D) recientemente descritos basados en tecnologías iPSC humanas.
Introduction
En las últimas tres décadas, el descubrimiento de fármacos basado en objetivos (TDD) ha sido ampliamente empleado en el descubrimiento de fármacos por la industria farmacéutica. TDD incorpora un objetivo molecular definido que desempeña un papel importante en una enfermedad y se basa en el desarrollo de sistemas de cultivo celular relativamente simples y lecturas para el cribado de fármacos1. Los modelos de enfermedad más típicos utilizados en los programas TDD incluyen métodos tradicionales de cultivo celular, como células cancerosas o líneas celulares inmortalizadas cultivadas en entornos artificiales y sustratos no fisiológicos. Aunque muchos de estos modelos han proporcionado herramientas viables para identificar candidatos a fármacos exitosos, el uso de tales sistemas puede ser cuestionable debido a su escasa relevancia de la enfermedad2.
Para la mayoría de las enfermedades, los mecanismos subyacentes son de hecho complejos y a menudo se encuentran varios tipos de células, vías de señalización independientes y múltiples conjuntos de genes que contribuyen a un fenotipo específico de la enfermedad. Esto también es cierto para las enfermedades hereditarias donde la causa principal es una mutación en un solo gen. Con el reciente advenimiento de las tecnologías de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y las herramientas de edición de genes, ahora es posible generar organoides 3D y modelos de enfermedades de órgano en chip que podrían recapitular mejor la complejidad humana in vivo 3,4. El desarrollo de tales tecnologías está asociado con un resurgimiento del interés en los programas de descubrimiento fenotípico de fármacos (PDD)1. El PDD se puede comparar con el cribado empírico, ya que no se basan en el conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico o en una hipótesis sobre su papel en la enfermedad. El enfoque PDD es ahora cada vez más reconocido por contribuir fuertemente al descubrimiento de fármacos de primera clase5. Debido a que el desarrollo de las tecnologías de organoides humanos y de órganos en chip aún está en su infancia, se espera que los modelos iPSC (complementados con herramientas innovadoras de imagen y aprendizaje automático6,7) proporcionen, en un futuro próximo, múltiples modelos novedosos de enfermedades complejas basadas en células para la detección de fármacos y programas de PDD asociados para superar la baja productividad del enfoque TDD8, 9.
Si bien los modelos de organoides humanos y órganos en chip pueden proporcionar información importante sobre la complejidad de la enfermedad y la identificación de nuevos fármacos, la incorporación de fármacos a la nueva práctica clínica también depende en gran medida de los datos de modelos animales para evaluar su eficacia y seguridad. Entre ellos, los ratones modificados genéticamente son sin duda los modelos de mamíferos más preferidos. Tienen muchas ventajas, ya que tienen un tiempo de generación relativamente corto para los mamíferos, tienen muchos fenotipos similares a las enfermedades humanas y pueden manipularse genéticamente fácilmente. Por lo tanto, son ampliamente utilizados en programas de descubrimiento de fármacos10. Sin embargo, cerrar la brecha entre ratones y humanos sigue siendo un desafío importante11. El desarrollo de modelos de ratón in vitro equivalentes a los modelos de organoides humanos y de órgano en chip podría llenar al menos parcialmente este vacío, ya que permitirá comparaciones directas de eficacia y seguridad de los medicamentos entre los datos in vivo de ratones y humanos in vitro .
Aquí, se describe un ensayo de germinación vascular en cuerpos embrioides (EB) de ratón. Los vasos sanguíneos están compuestos por células endoteliales (revestimiento interno de las paredes de los vasos), células murales (células del músculo liso vascular y pericitos)12. Este protocolo se basa en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) en EBs vascularizadas utilizando gotitas colgantes que recapitulan la diferenciación de novo de células endoteliales y células murales13,14. Las ESCs de ratón pueden establecerse fácilmente en cultivo a partir de blastocistos de ratón aislados del día 3,5 con diferentes antecedentes genéticos15. También ofrecen posibilidades para el análisis clonal, el rastreo del linaje y pueden ser fácilmente manipulados genéticamente para generar modelos de enfermedades13,16.
Como los vasos sanguíneos nutren todos los órganos, no es sorprendente que muchas enfermedades, si no todas, estén asociadas con cambios en la microvasculatura. En condiciones patológicas, las células endoteliales pueden adoptar un estado activado o pueden volverse disfuncionales, lo que resulta en la muerte de las células murales o la migración lejos de los vasos sanguíneos. Estos pueden resultar en angiogénesis excesiva o en rarefacción de los vasos, pueden inducir un flujo sanguíneo anormal y una barrera de vasos sanguíneos defectuosa que conduce a la extravasación de células inmunes e inflamación12,17,18,19. La investigación para el desarrollo de fármacos moduladores de los vasos sanguíneos es, por lo tanto, alta, y ya se han identificado múltiples actores y conceptos moleculares para la orientación terapéutica. En este contexto, el protocolo descrito es particularmente adecuado para construir modelos de enfermedades y para pruebas de drogas, ya que recapitula las características clave de la angiogénesis germinada in vivo, incluida la selección de células de la punta endotelial y el tallo, la migración y proliferación de células endoteliales, la guía de células endoteliales, la formación de tubos y el reclutamiento de células murales. También muestra similitudes con ensayos vasculares 3D recientemente descritos basados en tecnologías iPSC humanas20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un ensayo de germinación vascular basado en EB 3D imparcial, robusto y reproducible que es susceptible de detección de fármacos y genes que modulan la angiogénesis. Este método ofrece ventajas sobre muchos ensayos bidimensionales (2D) ampliamente utilizados que utilizan cultivos de células endoteliales como las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) para monitorear la migración (ensayo de rasguño lateral o el ensayo de cámara de Boyden)22,23 o proliferación (recuento …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, y por la Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
Referências
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