Denne analysen benytter musembryonale stamceller differensiert i embryoidlegemer dyrket i 3D-kollagengel for å analysere de biologiske prosessene som styrer spirende angiogenese in vitro. Teknikken kan brukes til å teste medisiner, modellere sykdommer, og for å studere spesifikke gener i sammenheng med delesjoner som er embryonisk dødelige.
Nylige fremskritt innen induserte pluripotente stamceller (iPSC) og genredigeringsteknologier muliggjør utvikling av nye humane cellebaserte sykdomsmodeller for fenotypisk legemiddeloppdagelse (PDD) -programmer. Selv om disse nye enhetene kunne forutsi sikkerheten og effekten av undersøkelsesmedisiner hos mennesker mer nøyaktig, er deres utvikling til klinikken fortsatt sterkt avhengig av pattedyrdata, særlig bruk av musesykdomsmodeller. Parallelt med humane organoide eller organ-on-chip sykdomsmodeller, er utviklingen av relevante in vitro musemodeller derfor et udekket behov for å evaluere direkte legemiddeleffekt og sikkerhetssammenligninger mellom arter og in vivo og in vitro forhold . Her beskrives en vaskulær spiringsanalyse som benytter museembryonale stamceller differensiert i embryoidlegemer (EB). Vaskulariserte EBer dyrket på 3D-kollagen gel utvikler nye blodkar som ekspanderer, en prosess som kalles spirende angiogenese. Denne modellen rekapitulerer viktige trekk ved in vivo spirende angiogenesedannelse av blodkar fra et eksisterende vaskulært nettverk – inkludert endotelcellevalg, endotelcellemigrasjon og proliferasjon, celleveiledning, rørdannelse og rekruttering av veggmalericeller. Det er egnet til screening for legemidler og gener som modulerer angiogenese og viser likheter med nylig beskrevne tredimensjonale (3D) vaskulære analyser basert på humane iPSC-teknologier.
I de siste tre tiårene har målbasert legemiddeloppdagelse (TDD) vært mye brukt i legemiddelforskning av farmasøytisk industri. TDD inkorporerer et definert molekylært mål som spiller en viktig rolle i en sykdom og er avhengig av utvikling av relativt enkle cellekultursystemer og avlesninger for legemiddelscreening1. De fleste typiske sykdomsmodeller som brukes i TDD-programmer inkluderer tradisjonelle cellekulturmetoder som kreftceller eller immortaliserte cellelinjer dyrket i kunstige miljøer og ikke-fysiologiske substrater. Selv om mange av disse modellene har gitt levedyktige verktøy for å identifisere vellykkede legemiddelkandidater, kan bruken av slike systemer være tvilsom på grunn av deres dårlige sykdomsrelevans2.
For de fleste sykdommer er de underliggende mekanismene faktisk komplekse, og forskjellige celletyper, uavhengige signalveier og flere sett med gener er ofte funnet å bidra til en bestemt sykdomsfenotype. Dette gjelder også for arvelige sykdommer der den primære årsaken er en mutasjon i ett enkelt gen. Med den nylige adventen av humaninduserte pluripotente stamcelleteknologier (iPSC) og genredigeringsverktøy, er det nå mulig å generere 3D-organoider og organ-on-chip sykdomsmodeller som bedre kan rekapitulere in vivo menneskelig kompleksitet 3,4. Utviklingen av slike teknologier er forbundet med en gjenoppblomstring i interessen for fenotypisk legemiddeloppdagelse (PDD) -programmer1. PDD kan sammenlignes med empirisk screening, da de ikke er avhengige av kunnskap om identiteten til et bestemt legemiddelmål eller en hypotese om dens rolle i sykdom. PDD-tilnærmingen er nå i økende grad anerkjent for å sterkt bidra til oppdagelsen av førsteklasses medisiner5. Fordi utviklingen av humane organoid- og organ-on-chip-teknologier fortsatt er i sin barndom, forventes det at iPSC-modeller (supplert med innovative bildebehandlings- og maskinlæringsverktøy6,7) i nær fremtid vil gi flere nye komplekse cellebaserte sykdomsmodeller for narkotikascreening og tilhørende PDD-programmer for å overvinne den dårlige produktiviteten til TDD-tilnærmingen8, 9.
Mens humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan gi viktig innsikt i sykdomskompleksitet og identifisering av nye legemidler, er det å bringe medisiner inn i ny klinisk praksis også sterkt avhengig av data fra dyremodeller for å vurdere deres effekt og sikkerhet. Blant dem er genmodifiserte mus absolutt de mest foretrukne pattedyrmodellene. De har mange fordeler da de har en relativt kort generasjonstid for pattedyr, har mange lignende fenotyper til menneskelige sykdommer, og kan lett genetisk manipuleres. De er derfor mye brukt i narkotikaoppdagelsesprogrammer10. Å bygge bro mellom mus og mennesker er imidlertid fortsatt en viktig utfordring11. Utviklingen av in vitro musemodeller tilsvarende humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan i det minste delvis fylle dette gapet, da det vil muliggjøre direkte sammenligning av legemiddeleffekt og sikkerhet mellom in vivo mus og in vitro humane data.
Her beskrives en vaskulær spiringsanalyse i museembryoidlegemer (EB). Blodkar består av endotelceller (indre foring av karvegger), veggmalericeller (vaskulære glatte muskelceller og pericytter)12. Denne protokollen er basert på differensiering av musembryonale stamceller (mESC) til vaskulariserte EBer ved bruk av hengende dråper som rekapitulerer de novo endotelcelle- og veggmalericelledifferensiering13,14. Mus ESC kan enkelt etableres i kultur fra isolert dag 3.5 mus blastocyster med forskjellig genetisk bakgrunn15. De gir også muligheter for klonal analyse, avstamningssporing, og kan lett genetisk manipuleres for å generere sykdomsmodeller13,16.
Siden blodkar nærer alle organer, er det ikke overraskende at mange sykdommer, om ikke alle, er forbundet med endringer i mikrovaskulaturen. Under patologiske forhold kan endotelceller vedta en aktivert tilstand eller bli dysfunksjonelle, noe som resulterer i veggmalericelledød eller migrasjon bort fra blodkar. Disse kan resultere i overdreven angiogenese eller i karets sjeldenhet, kan indusere unormal blodstrøm og defekt blodkarbarriere som fører til ekstravasasjon av immunceller og betennelse12,17,18,19. Forskning for utvikling av medikamentmodulerende blodkar er derfor høy, og flere molekylære aktører og konsepter er allerede identifisert for terapeutisk målretting. I denne sammenheng er den beskrevne protokollen spesielt egnet for å bygge sykdomsmodeller og for narkotikatesting, da den rekapitulerer viktige trekk ved in vivo spirende angiogenese, inkludert endotelspiss og stengelcellevalg, endotelcellemigrasjon og proliferasjon, endotelcelleveiledning, rørdannelse og rekruttering av veggmalericeller. Det viser også likheter med nylig beskrevne 3D vaskulære analyser basert på humane iPSC-teknologier20.
Denne protokollen beskriver en objektiv, robust og reproduserbar 3D EB-basert vaskulær spiringsanalyse som er egnet til screening for legemidler og gener som modulerer angiogenese. Denne metoden gir fordeler i forhold til mange mye brukte todimensjonale (2D) analyser ved bruk av endotelcellekulturer som Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) for å overvåke migrasjon (lateral scratch assay eller Boyden chamber assay)22,23 eller spredning (telling av cellenummer, påvisning av DNA-syntese, påvisning…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, og av Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |