В данной статье представлен маломасштабный протокол изоляции плазматической мембраны для характеристики белка Candida albicans ABC (АТФ-связывающая кассета) Cdr1, сверхэкспрессированного в Saccharomyces cerevisiae. Расщепленная протеаза C-концевая двойная метка mGFPHis с 16-остатчным линкером между Cdr1 и меткой была разработана для облегчения очистки и моющего скрининга Cdr1.
Успешная биохимическая и биофизическая характеристика АВС-транспортеров в значительной степени зависит от выбора гетерологии системы экспрессии. За последние два десятилетия мы разработали платформу экспрессии белка дрожжевой мембраны, которая использовалась для изучения многих важных белков грибковых мембран. Экспрессия хозяина Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ удалена в семи основных эндогенных переносчиках ABC и содержит транскрипционный фактор Pdr1-3 с мутацией усиления функции, которая позволяет конститутивную сверхэкспрессию генов гетерологийного мембранного белка, стабильно интегрированных в виде одиночных копий в геномном локусе PDR5. Создание универсальных плазмидных векторов и оптимизация одноэтапных стратегий клонирования позволяет быстро и точно клонировать, мутагенез и экспрессию гетерологийных ABC-транспортеров. Здесь мы описываем разработку и использование новой протеазно-расщепляемой двойной метки mGFPHis (т.е. мономерного дрожжевого усиленного зеленого флуоресцентного белка yEGFP3, сплавленного с шестигистидиновой меткой очистки с аффинностью), которая была разработана, чтобы избежать возможного вмешательства метки в интересующий белок и повысить эффективность связывания метки His с никель-аффинными смолами. Слияние mGFPHis с мембранным белком ORF (открытая рамка считывания) позволяет легко количественно оценить белок путем проверки полиакриламидных гелей и обнаружения продуктов деградации, сохраняющих метку mGFPHis. Мы демонстрируем, как эта функция облегчает скрининг моющих средств для солюбилизации мембранного белка. Представлен протокол эффективной, быстрой и надежной изоляции мелкомасштабных плазматических мембранных препаратов C-терминально помеченного мультилекарственного транспортера излияния Candida albicans Cdr1, переэкспрессированного в S. cerevisiae ADΔΔ. Этот маломасштабный протокол изоляции плазматических мембран генерирует высококачественные плазматические мембраны в течение одного рабочего дня. Препараты плазматической мембраны могут быть использованы для определения ферментной активности мутантных вариантов Cdr1 и Cdr1.
Извлечение интегральных мембранных белков из их родной липидной среды может резко повлиять на их структуру и функцию1,2,3,4. Комплексный липидный состав биологических мембран5 обеспечивает возможность критически важных белково-липидных взаимодействий6. Липиды поддерживают структурную целостность мембранных белков, что позволяет им правильно функционировать в своем мембранном отсеке назначения (назначениях)7,8. Поэтому критическим первым шагом в очистке мембранного белка является извлечение белка из его родной среды без влияния на его структуру и / или функцию.
Существует множество препятствий для характеристики структуры мембранных белков, большинство из которых связаны с их гидрофобной природой, а также трудностями экспрессии правильно свернутых и функциональных мембранных белков в количествах, необходимых для рентгеновской кристаллографии или криоэлектроновой микроскопии (крио-ЭМ)9,10,11,12. Существует три типа мембранных белковых экспрессии систем: гомологичные9,гетерологичные13,14,15и системы экспрессии in vitro 16,17. Часто низкие уровни экспрессии или непомерно низкие затраты многих систем экспрессии оставляют только несколько хозяев в качестве предпочтительного варианта для производства мембранных белков. Они включают бактериального хозяина, Escherichia coli,дрожжи S. cerevisiae и Pichia pastorisи высшие эукариоты, такие как клетки насекомых Sf9 или клеточные линии млекопитающих18. Все технологии экспрессии мембранных белков имеют свои преимущества и недостатки; однако S. cerevisiae является, пожалуй, наиболее изученным эукариотическим модельным организмом, пригодным для производства мембранного белка. Он очень универсален с приложениями в генной инженерии, открытии лекарств, синтетической биологии и экспрессии белков эукариотической мембраны14,19,20,21.
В этом исследовании была использована запатентованная технология экспрессии мембранного белка S. cerevisiae 21, с S. cerevisiae ADΔ14 и ADΔΔ22 в качестве предпочтительных хозяев(фиг.1A),для сверхэкспрессии и изучения основного мультилекарственного эффлюксного насоса Cr1. Оба штамма S. cerevisiae являются производными AD1-8u-23, которые имеют либо ura3 (ADΔ), либо оба гена ura3 и his1 (ADΔΔ), удаленные для устранения любых ложноположительных прототрофных трансформантов урацила или гистидина, возникающих в результате нежелательной интеграции в геномных локусах URA3 или HIS1. Удаление 7 основных мультилекарственных эффлюксных насосов23,указанных на фиг.1A, делает ADΔΔ чрезвычайно чувствительным к большинству ксенобиотиков. Мутантный транскрипционный фактор усиления функции Pdr1-3 вызывает конститутивную сверхэкспрессию гетерологичных мембранных белков, таких как Cdr1 (красные восьмиугольники на фиг.1A)после интеграции гетерологично-ORF-содержащей кассеты трансформации(рисунок 1A)в геномном локусе PDR5 (синий прямоугольник на фиг.1A)посредством двух гомологичных событий рекомбинации. Правильная локализация плазматической мембраны С-концевых mGFPHis помеченных белков может быть подтверждена конфокальной микроскопией(рисунок 1А),а метка His может быть использована для никель-аффинной очистки помеченного белка. Однако клонирование некоторых грибковых транспортеров ABC (например, Candida krusei ABC1)в плазмиды, полученные из pABC3, было невозможным, поскольку они не могли быть распространены в кишечной палочке из-за клеточной токсичности. Это побудило к разработке одноэтапного клонирования мембранных белков14,24, помеченных либо на их N-, либо на C-конце с различным сродством, эпитопом или репортерными метками непосредственно в S. cerevisiae ADΔΔ(рисунок 1C). S. cerevisiae Штаммы ADΔΔ, чрезмерно экспрессирующие различные мутанты CDR1, также могут быть эффективно созданы таким образом, используя до пяти отдельных фрагментов ПЦР, которые перекрываются на 25 bp(рисунок 1C). Используя этот протокол, многие интересующие ORF могут быть клонированы, выражены и охарактеризованы с низкой стоимостью и высокой эффективностью в течение очень короткого промежутка времени. Эффективность трансформации снижается всего в ~2 раза с каждым дополнительным фрагментом ПЦР.
При желании уровнями выражений также можно легко манипулировать с помощью праймерного дизайна, чтобы предсказуемо настроить уровни выражений до 0,1%-50% от обычно высоких, конститутивных уровней выражения25. Оптимизированный, многофункциональный вектор клонированияpABC3 14, pABC3-XLmGFPHis26 (рисунок 1B)содержит участок расщепления протеазы HRV-3C (X; ЛЕВЛЬФК| GP), протеаза, которая работает лучше при 4 ° C, чем часто используемая протеаза вируса травля табака (TEV)27. L представляет собой линкер с пятью аминокислотами (GSGGS), mGFP представляет собой мономерный мутант (A206K)28,29 версию дрожжевого усиленного зеленофлуоресцентного варианта белка yEGFP330,а His представляет собой трехаломиновый линкер (GGS), за которым следует шестигистидинная (HHHHHH) никель-аффинная белковая очистка метка.
Эта технология экспрессии была успешно использована в открытии лекарств и изучении мембранных белков. Первая структура грибкового азолового препарата-мишени, S. cerevisiae Erg1131,была решена с использованием этой технологии. Это также позволило детально охарактеризовать C. albicans Cdr132, 33,34и создать молекулу Cdr1с дефицитом цистеина35, подходящую для исследований сшивания цистеина для проверки любой будущей структуры с высоким разрешением. Многие другие abc-транспортеры из основных грибковых патогенов человека (например, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei и видовой комплекс Fusarium solani) также были подробно изучены с использованием этой платформы экспрессии24,36,37,38,39. Это позволило создать панель штаммов S. cerevisiae, чрезмерно экспрессирующих эфлюксные насосы, которые были использованы в высокопроизводительных экранах, чтобы обнаружить новую флуоресцентную подложку эфлюксного насоса Nile red40 и 41 и широкого спектра действия ингибиторов эфлюксного насоса14,33,43,44. Использование этой системы также позволило обнаружить клоргилин в качестве первого в своем роде грибкового ингибитора мультилекарственного эфлюксного насоса широкого спектра действия42.
Полная солюбилизация мембранных белков и создание однородного мембранного белково-мицеллевого препарата, лишенного эндогенных липидов, требует высоких концентраций детергентов45. Но, к сожалению, это также часто инактивирует мембранный белок5,8,45,46. На свойства моющих мономеров и их агрегацию в растворе влияют физические свойства гидрофобного хвоста, длина и ветвление алкильной цепи, наличие ароматического ядра или фторалкильной боковой цепи или количество полиоксиэтиленовых единиц. Таким образом, скрининг моющих средств является важным первым шагом для определения наиболее подходящего моющего средства для солюбилизации и очистки мембранного белка.
C. albicans является основным грибковым патогеном человека лиц с ослабленным иммунитетом, который может вызывать серьезные, опасные для жизни инвазивные инфекции47,и он может стать устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам48,49. Одним из основных механизмов мультилекарственности C. albicans является сверхэкспрессия Cdr150,который является ПЕРЕНОСЧИКОМ51 подсемейства ABCG типа II, расположенным в плазматической мембране. Полноразмерные грибковые транспортеры ABCG (состоящие из двух нуклеотидсвязывающих доменов [NBD] и двух трансмембранных доменов [TMD]) более известны как переносчики плейотропной лекарственной устойчивости (PDR) и характеризуются их уникальной инвертированной доменной топологией [NBD-TMD]2. Транспортеры PDR встречаются только в растениях52,53 и грибах54. Несмотря на их важность, нет никаких конструкций для транспортеров PDR, хотя недавно были решены конструкции для транспортеров ABCG половинного размера, что помогло создать первую предварительную модель для Cdr133. Однако наши недавние экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эта модель является ошибочной, возможно, потому, что грибковые транспортеры PDR имеют характерные асимметричные NBD, что, вполне возможно, приводит к уникальному транспортному механизму. Таким образом, структура Cdr1 с высоким разрешением необходима как для рационального проектирования новых ингибиторов эфлюксного насоса, которые могут помочь преодолеть опосредованную из потоком лекарственную устойчивость, так и для понимания механизма действия этого важного семейства транспортеров ABC.
Целью данного исследования была разработка надежных протоколов экспрессии, солюбилизации и очистки Cdr1 в генетически модифицированном хозяине экспрессии S. cerevisiae с конечной целью получения структуры высокого разрешения для Cdr1. В рамках этого процесса была разработана протеазно-расщепляемая двойная метка mGFPHis(рисунок 1B)с 16-остаточной линкером, отделяющей метку от C-конца Cdr1, что улучшило связывание прикрепленной 6x его метки сродства с никелем-аффинной смолой и позволило контролировать уровни экспрессии Cdr1 в живых клетках и во время всего процесса очистки. Также был разработан воспроизводимый протокол для мелкомасштабных дрожжевых препаратов белка плазматической мембраны, содержащих около 10% C. albicans Cdr1 (по оценкам окрашивания Кумасси после SDS-PAGE), который может быть использован для биохимической характеристики Cdr1.
Несмотря на недавний прогресс в структурном анализе мембранных белков, в настоящее время нет 3D-структуры для Cdr1 или любого другого транспортера PDR. Таким образом, получение знаний о структуре Cdr1 и ее биохимических особенностях важно, поскольку это не только даст представление о рациона…
The authors have nothing to disclose.
Авторы с благодарностью отмечают финансирование из Новозеландского фонда Марсдена (грант UOO1305) и блочный грант от медицинского факультета Университета Чулалонгкорн, Бангкок, Таиланд (М. Ниими). Они хотели бы поблагодарить Университет Отаго за предоставление Г. Мадани стипендии PhD. Авторы также хотели бы выразить свою благодарность профессору Штефану Раунсеру и его коллегам, доктору Амиру Апельбауму и доктору Дейванаягабарати Винаягаму, за их поддержку и руководство во время 6-месячного визита Г. Мадани в Институт молекулярной физиологии Макса Планка (MPIMP), Дортмунд, Германия. Авторы также благодарят Немецкую службу академических обменов (DAAD) за предоставление Г. Мадани исследовательского гранта (57381332) для посещения MPIMP.
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG310S | LMNG |
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG322S | DMNG |
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
CHAPS | Anatrace | C316S | |
CHAPSO | Anatrace | C317S | |
CSM | Formedium | DCS0019 | |
CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
DMSO | Merck | 67-68-5 | |
Ethanol | Merck | 459836 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | A blend of exonuclease and phosphatase |
Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
Glycine | Merck | G8898 | |
HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003172510 | |
KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Use for reliable colony PCR |
lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
MES | Formedium | 145224-94-8 | |
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
n-Decyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D322S | DM |
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside | Anatrace | D310HA | α-DDM |
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310S | β-DDM |
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T315S | TDM |
n-Tridecyl-phosphocholine | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T323S | – |
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
polyethylene glycol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
polyoxyethylenesorbitan monooleate | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P8394 | |
Protein Assay Kit | Bio-Rad | 5000122 | RC DC Protein Assay Kit II |
QC Colloidal Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
Sodium L-ascorbate BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
Yeast extract | Formedium | 008013-01-2 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
Equipment (type) | |||
Centrifuge (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) | Bio-Rad | ||
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
PCR thermal cycler (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
Power supply (PowerPac) | Bio-Rad | ||
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
Shaking incubator (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |