JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Маломасштабная плазматическая мембранная подготовка для анализа Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021
doi:
10.3791/62592
, , , , ,
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry,University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine,Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences,University of Auckland

Summary

В данной статье представлен маломасштабный протокол изоляции плазматической мембраны для характеристики белка Candida albicans ABC (АТФ-связывающая кассета) Cdr1, сверхэкспрессированного в Saccharomyces cerevisiae. Расщепленная протеаза C-концевая двойная метка mGFPHis с 16-остатчным линкером между Cdr1 и меткой была разработана для облегчения очистки и моющего скрининга Cdr1.

Abstract

Успешная биохимическая и биофизическая характеристика АВС-транспортеров в значительной степени зависит от выбора гетерологии системы экспрессии. За последние два десятилетия мы разработали платформу экспрессии белка дрожжевой мембраны, которая использовалась для изучения многих важных белков грибковых мембран. Экспрессия хозяина Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ удалена в семи основных эндогенных переносчиках ABC и содержит транскрипционный фактор Pdr1-3 с мутацией усиления функции, которая позволяет конститутивную сверхэкспрессию генов гетерологийного мембранного белка, стабильно интегрированных в виде одиночных копий в геномном локусе PDR5. Создание универсальных плазмидных векторов и оптимизация одноэтапных стратегий клонирования позволяет быстро и точно клонировать, мутагенез и экспрессию гетерологийных ABC-транспортеров. Здесь мы описываем разработку и использование новой протеазно-расщепляемой двойной метки mGFPHis (т.е. мономерного дрожжевого усиленного зеленого флуоресцентного белка yEGFP3, сплавленного с шестигистидиновой меткой очистки с аффинностью), которая была разработана, чтобы избежать возможного вмешательства метки в интересующий белок и повысить эффективность связывания метки His с никель-аффинными смолами. Слияние mGFPHis с мембранным белком ORF (открытая рамка считывания) позволяет легко количественно оценить белок путем проверки полиакриламидных гелей и обнаружения продуктов деградации, сохраняющих метку mGFPHis. Мы демонстрируем, как эта функция облегчает скрининг моющих средств для солюбилизации мембранного белка. Представлен протокол эффективной, быстрой и надежной изоляции мелкомасштабных плазматических мембранных препаратов C-терминально помеченного мультилекарственного транспортера излияния Candida albicans Cdr1, переэкспрессированного в S. cerevisiae ADΔΔ. Этот маломасштабный протокол изоляции плазматических мембран генерирует высококачественные плазматические мембраны в течение одного рабочего дня. Препараты плазматической мембраны могут быть использованы для определения ферментной активности мутантных вариантов Cdr1 и Cdr1.

Introduction

Извлечение интегральных мембранных белков из их родной липидной среды может резко повлиять на их структуру и функцию1,2,3,4. Комплексный липидный состав биологических мембран5 обеспечивает возможность критически важных белково-липидных взаимодействий6. Липиды поддерживают структурную целостность мембранных белков, что позволяет им правильно функционировать в своем мембранном отсеке назначения (назначениях)7,8. Поэтому критическим первым шагом в очистке мембранного белка является извлечение белка из его родной среды без влияния на его структуру и / или функцию.

Существует множество препятствий для характеристики структуры мембранных белков, большинство из которых связаны с их гидрофобной природой, а также трудностями экспрессии правильно свернутых и функциональных мембранных белков в количествах, необходимых для рентгеновской кристаллографии или криоэлектроновой микроскопии (крио-ЭМ)9,10,11,12. Существует три типа мембранных белковых экспрессии систем: гомологичные9,гетерологичные13,14,15и системы экспрессии in vitro 16,17. Часто низкие уровни экспрессии или непомерно низкие затраты многих систем экспрессии оставляют только несколько хозяев в качестве предпочтительного варианта для производства мембранных белков. Они включают бактериального хозяина, Escherichia coli,дрожжи S. cerevisiae и Pichia pastorisи высшие эукариоты, такие как клетки насекомых Sf9 или клеточные линии млекопитающих18. Все технологии экспрессии мембранных белков имеют свои преимущества и недостатки; однако S. cerevisiae является, пожалуй, наиболее изученным эукариотическим модельным организмом, пригодным для производства мембранного белка. Он очень универсален с приложениями в генной инженерии, открытии лекарств, синтетической биологии и экспрессии белков эукариотической мембраны14,19,20,21.

В этом исследовании была использована запатентованная технология экспрессии мембранного белка S. cerevisiae 21, с S. cerevisiae ADΔ14 и ADΔΔ22 в качестве предпочтительных хозяев(фиг.1A),для сверхэкспрессии и изучения основного мультилекарственного эффлюксного насоса Cr1. Оба штамма S. cerevisiae являются производными AD1-8u-23, которые имеют либо ura3 (ADΔ), либо оба гена ura3 и his1 (ADΔΔ), удаленные для устранения любых ложноположительных прототрофных трансформантов урацила или гистидина, возникающих в результате нежелательной интеграции в геномных локусах URA3 или HIS1. Удаление 7 основных мультилекарственных эффлюксных насосов23,указанных на фиг.1A, делает ADΔΔ чрезвычайно чувствительным к большинству ксенобиотиков. Мутантный транскрипционный фактор усиления функции Pdr1-3 вызывает конститутивную сверхэкспрессию гетерологичных мембранных белков, таких как Cdr1 (красные восьмиугольники на фиг.1A)после интеграции гетерологично-ORF-содержащей кассеты трансформации(рисунок 1A)в геномном локусе PDR5 (синий прямоугольник на фиг.1A)посредством двух гомологичных событий рекомбинации. Правильная локализация плазматической мембраны С-концевых mGFPHis помеченных белков может быть подтверждена конфокальной микроскопией(рисунок 1А),а метка His может быть использована для никель-аффинной очистки помеченного белка. Однако клонирование некоторых грибковых транспортеров ABC (например, Candida krusei ABC1)в плазмиды, полученные из pABC3, было невозможным, поскольку они не могли быть распространены в кишечной палочке из-за клеточной токсичности. Это побудило к разработке одноэтапного клонирования мембранных белков14,24, помеченных либо на их N-, либо на C-конце с различным сродством, эпитопом или репортерными метками непосредственно в S. cerevisiae ADΔΔ(рисунок 1C). S. cerevisiae Штаммы ADΔΔ, чрезмерно экспрессирующие различные мутанты CDR1, также могут быть эффективно созданы таким образом, используя до пяти отдельных фрагментов ПЦР, которые перекрываются на 25 bp(рисунок 1C). Используя этот протокол, многие интересующие ORF могут быть клонированы, выражены и охарактеризованы с низкой стоимостью и высокой эффективностью в течение очень короткого промежутка времени. Эффективность трансформации снижается всего в ~2 раза с каждым дополнительным фрагментом ПЦР. 

При желании уровнями выражений также можно легко манипулировать с помощью праймерного дизайна, чтобы предсказуемо настроить уровни выражений до 0,1%-50% от обычно высоких, конститутивных уровней выражения25. Оптимизированный, многофункциональный вектор клонированияpABC3 14, pABC3-XLmGFPHis26 (рисунок 1B)содержит участок расщепления протеазы HRV-3C (X; ЛЕВЛЬФК| GP), протеаза, которая работает лучше при 4 ° C, чем часто используемая протеаза вируса травля табака (TEV)27. L представляет собой линкер с пятью аминокислотами (GSGGS), mGFP представляет собой мономерный мутант (A206K)28,29 версию дрожжевого усиленного зеленофлуоресцентного варианта белка yEGFP330,а His представляет собой трехаломиновый линкер (GGS), за которым следует шестигистидинная (HHHHHH) никель-аффинная белковая очистка метка.

Эта технология экспрессии была успешно использована в открытии лекарств и изучении мембранных белков. Первая структура грибкового азолового препарата-мишени, S. cerevisiae Erg1131,была решена с использованием этой технологии. Это также позволило детально охарактеризовать C. albicans Cdr132, 33,34и создать молекулу Cdr1с дефицитом цистеина35, подходящую для исследований сшивания цистеина для проверки любой будущей структуры с высоким разрешением. Многие другие abc-транспортеры из основных грибковых патогенов человека (например, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei и видовой комплекс Fusarium solani) также были подробно изучены с использованием этой платформы экспрессии24,36,37,38,39. Это позволило создать панель штаммов S. cerevisiae, чрезмерно экспрессирующих эфлюксные насосы, которые были использованы в высокопроизводительных экранах, чтобы обнаружить новую флуоресцентную подложку эфлюксного насоса Nile red40 и 41 и широкого спектра действия ингибиторов эфлюксного насоса14,33,43,44. Использование этой системы также позволило обнаружить клоргилин в качестве первого в своем роде грибкового ингибитора мультилекарственного эфлюксного насоса широкого спектра действия42.

Полная солюбилизация мембранных белков и создание однородного мембранного белково-мицеллевого препарата, лишенного эндогенных липидов, требует высоких концентраций детергентов45. Но, к сожалению, это также часто инактивирует мембранный белок5,8,45,46. На свойства моющих мономеров и их агрегацию в растворе влияют физические свойства гидрофобного хвоста, длина и ветвление алкильной цепи, наличие ароматического ядра или фторалкильной боковой цепи или количество полиоксиэтиленовых единиц. Таким образом, скрининг моющих средств является важным первым шагом для определения наиболее подходящего моющего средства для солюбилизации и очистки мембранного белка.

C. albicans является основным грибковым патогеном человека лиц с ослабленным иммунитетом, который может вызывать серьезные, опасные для жизни инвазивные инфекции47,и он может стать устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам48,49. Одним из основных механизмов мультилекарственности C. albicans является сверхэкспрессия Cdr150,который является ПЕРЕНОСЧИКОМ51 подсемейства ABCG типа II, расположенным в плазматической мембране. Полноразмерные грибковые транспортеры ABCG (состоящие из двух нуклеотидсвязывающих доменов [NBD] и двух трансмембранных доменов [TMD]) более известны как переносчики плейотропной лекарственной устойчивости (PDR) и характеризуются их уникальной инвертированной доменной топологией [NBD-TMD]2. Транспортеры PDR встречаются только в растениях52,53 и грибах54. Несмотря на их важность, нет никаких конструкций для транспортеров PDR, хотя недавно были решены конструкции для транспортеров ABCG половинного размера, что помогло создать первую предварительную модель для Cdr133. Однако наши недавние экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эта модель является ошибочной, возможно, потому, что грибковые транспортеры PDR имеют характерные асимметричные NBD, что, вполне возможно, приводит к уникальному транспортному механизму. Таким образом, структура Cdr1 с высоким разрешением необходима как для рационального проектирования новых ингибиторов эфлюксного насоса, которые могут помочь преодолеть опосредованную из потоком лекарственную устойчивость, так и для понимания механизма действия этого важного семейства транспортеров ABC.

Целью данного исследования была разработка надежных протоколов экспрессии, солюбилизации и очистки Cdr1 в генетически модифицированном хозяине экспрессии S. cerevisiae с конечной целью получения структуры высокого разрешения для Cdr1. В рамках этого процесса была разработана протеазно-расщепляемая двойная метка mGFPHis(рисунок 1B)с 16-остаточной линкером, отделяющей метку от C-конца Cdr1, что улучшило связывание прикрепленной 6x его метки сродства с никелем-аффинной смолой и позволило контролировать уровни экспрессии Cdr1 в живых клетках и во время всего процесса очистки. Также был разработан воспроизводимый протокол для мелкомасштабных дрожжевых препаратов белка плазматической мембраны, содержащих около 10% C. albicans Cdr1 (по оценкам окрашивания Кумасси после SDS-PAGE), который может быть использован для биохимической характеристики Cdr1.

Protocol

1. Подготовка свежих или замороженных запасов трансформационных компетентных ADΔ и ADΔΔ клеток Инокулировать 25 мл 2x YPCD [т.е. 2x YPD; 2% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 4% (мас./об.) декстрозы), 0,079% (мас./об.) CSM (полная смесь добавок)]35 среды с одной дрожжевой колон?…

Representative Results

Высокая частота превращения S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 трансформантов/мкг) была достигнута с помощью pYES2(рисунок 2B). Как и ожидалось, управление без ДНК (т.е.толькоddH 2 O) не давало трансформаторов, а 1 мкг линейной кассеты преобразования CDR1-mGFPHis (?…

Discussion

Несмотря на недавний прогресс в структурном анализе мембранных белков, в настоящее время нет 3D-структуры для Cdr1 или любого другого транспортера PDR. Таким образом, получение знаний о структуре Cdr1 и ее биохимических особенностях важно, поскольку это не только даст представление о рациона…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы с благодарностью отмечают финансирование из Новозеландского фонда Марсдена (грант UOO1305) и блочный грант от медицинского факультета Университета Чулалонгкорн, Бангкок, Таиланд (М. Ниими). Они хотели бы поблагодарить Университет Отаго за предоставление Г. Мадани стипендии PhD. Авторы также хотели бы выразить свою благодарность профессору Штефану Раунсеру и его коллегам, доктору Амиру Апельбауму и доктору Дейванаягабарати Винаягаму, за их поддержку и руководство во время 6-месячного визита Г. Мадани в Институт молекулярной физиологии Макса Планка (MPIMP), Дортмунд, Германия. Авторы также благодарят Немецкую службу академических обменов (DAAD) за предоставление Г. Мадани исследовательского гранта (57381332) для посещения MPIMP.

Materials

2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S –
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. . Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins–a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Bioquímica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genética. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5′ proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D., Prasad, R. . Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. , 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Plasma MembraneCandida AlbicansCdr1-mGFPHisMembrane ProteinSmall-scale IsolationATPaseDetergentCell HarvestingPre-cultureCell LysisCentrifugationHomogenization Buffer
check_url/pt/62592?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image