JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021
doi:
10.3791/62592
, , , , ,
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry,University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine,Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences,University of Auckland

Summary

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Abstract

De succesvolle biochemische en biofysische karakterisering van ABC-transporters hangt sterk af van de keuze van het heterologe expressiesysteem. In de afgelopen twee decennia hebben we een gistmembraaneiwitexpressieplatform ontwikkeld dat is gebruikt om veel belangrijke schimmelmembraaneiwitten te bestuderen. De uitdrukking host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wordt verwijderd in zeven belangrijke endogene ABC-transporters en bevat de transcriptiefactor Pdr1-3 met een gain-of-function mutatie die de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitgenen stabiel geïntegreerd als enkele kopieën op de genomische PDR5-locus mogelijk maakt. De creatie van veelzijdige plasmidevectoren en de optimalisatie van kloonstrategieën in één stap maakt het snel en nauwkeurig klonen, mutagenese en expressie van heterologe ABC-transporters mogelijk. Hier beschrijven we de ontwikkeling en het gebruik van een nieuwe protease-splijtbare mGFPHis dubbele tag (d.w.z. het monomere gistversterkte groene fluorescerende eiwit yEGFP3 gefuseerd tot een zes-histidine affiniteit zuiveringslabel) dat is ontworpen om mogelijke interferentie van de tag met het eiwit van belang te voorkomen en om de bindingsefficiëntie van de His-tag aan nikkel-affiniteitsharsen te verhogen. De fusie van mGFPHis met het membraaneiwit ORF (open leesframe) maakt eenvoudige kwantificering van het eiwit mogelijk door inspectie van polyacrylamidegels en detectie van afbraakproducten die het mGFPHis-label behouden. We laten zien hoe deze functie de screening van reinigingsmiddelen op oplosbaarheid van membraaneiwitten vergemakkelijkt. Een protocol voor de efficiënte, snelle en betrouwbare isolatie van de kleinschalige plasmamembraanpreparaten van de C-terminaal gelabelde Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressie in S. cerevisiae ADΔΔ, wordt gepresenteerd. Dit kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol genereert binnen één werkdag hoogwaardige plasmamembranen. De plasmamembraanpreparaten kunnen worden gebruikt om de enzymactiviteiten van Cdr1- en Cdr1-mutante varianten te bepalen.

Introduction

De extractie van integrale membraaneiwitten uit hun oorspronkelijke lipideomgeving kan hun structuur en functie dramatisch beïnvloeden1,2,3,4. De complexe lipidesamenstelling van biologische membranen5 zorgt ervoor dat kritisch belangrijke eiwit-lipide interacties kunnen optreden6. Lipiden behouden de structurele integriteit van membraaneiwitten, waardoor ze correct kunnen functioneren in hun membraancompartimentbestemming(en)7,8. Daarom is een cruciale eerste stap in de membraaneiwitzuivering de extractie van het eiwit uit zijn oorspronkelijke omgeving zonder de structuur en / of functie ervan te beïnvloeden.

Er zijn veel obstakels voor het karakteriseren van de structuur van membraaneiwitten, waarvan de meeste verband houden met hun hydrofobe aard, en de moeilijkheden bij het tot expressie brengen van goed gevouwen en functionele membraaneiwitten in de hoeveelheden die nodig zijn voor röntgenkristallografie of cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM)9,10,11,12. Er zijn drie soorten membraaneiwitexpressiesystemen: homoloog9,heterologe13,14,15en in vitro expressiesystemen16,17. De vaak lage expressieniveaus, of de onbetaalbare kosten, van veel expressiesystemen laten slechts een paar gastheren over als de voorkeursoptie om membraaneiwitten te produceren. Ze omvatten de bacteriële gastheer, Escherichia coli,de gisten S. cerevisiae pt Pichia pastoris,en hogere eukaryoten zoals Sf9-insectencellen of zoogdiercellijnen18. Alle membraaneiwitexpressietechnologieën hebben voor- en nadelen; S. cerevisiae is echter misschien wel het best bestudeerde eukaryote modelorganisme dat geschikt is voor de productie van membraaneiwitten. Het is zeer veelzijdig met toepassingen in genetische manipulatie, geneesmiddelenontdekking, synthetische biologie en de expressie van eukaryote membraaneiwitten14,19,20,21.

In deze studie werd een gepatenteerde S. cerevisiae membraaneiwitexpressietechnologie21 gebruikt, met S. cerevisiae ADΔ14 en ADΔΔ22 als de voorkeursgastheren (Figuur 1A), om de belangrijkste C. albicans multidrug effluxpomp Cdr1 te overexpresseren en te bestuderen. Beide S. cerevisiae stammen zijn afgeleiden van AD1-8u– 23 die ofwel de ura3 (ADΔ) of zowel de ura3 als de his1 (ADΔΔ) genen verwijderd hebben om vals positieve uracil of histidine prototrofe transformaties te elimineren die ontstaan door de ongewenste integratie bij de URA3 of de HIS1 genomische loci. Het schrappen van de 7 belangrijkste multidrug effluxpompen23, aangegeven in figuur 1A, maakt ADΔΔ buitengewoon gevoelig voor de meeste xenobiotica. De gain-of-function mutante transcriptiefactor Pdr1-3 veroorzaakt de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitten zoals Cdr1 (rode achthoeken in figuur 1A) na integratie van de heterologe-ORF-bevattende transformatiecassette (figuur 1A) op de genomische PDR5-locus (blauwe rechthoek in figuur 1A) via twee homologe recombinatiegebeurtenissen. Een goede plasmamembraanlokalisatie van C-terminaal mGFPHis-gelabelde eiwitten kan worden bevestigd door confocale microscopie (Figuur 1A), en de His-tag kan worden gebruikt voor nikkel-affiniteitszuivering van het gelabelde eiwit. Het klonen van sommige schimmel ABC-transporters (bijv. Candida krusei ABC1) in pABC3-afgeleide plasmiden was echter niet mogelijk omdat ze niet konden worden vermeerderd in Escherichia coli vanwege celtoxiciteit. Dit leidde tot de ontwikkeling van het klonen in één stap van membraaneiwitten14,24 gelabeld op hun N- of C-eindpunt met verschillende affiniteits-, epitoop- of reportertags rechtstreeks in S. cerevisiae ADΔΔ (Figuur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammen die verschillende CDR1-mutanten overexpresseren, kunnen op deze manier ook efficiënt worden gemaakt door maximaal vijf individuele PCR-fragmenten te gebruiken die elkaar 25 bp overlappen(figuur 1C). Met behulp van dit protocol kunnen veel ORF’s van belang worden gekloond, uitgedrukt en gekarakteriseerd tegen lage kosten en met een hoog rendement binnen een zeer korte tijdspanne. De transformatie-efficiëntie vermindert slechts ~ 2-voudig met elk extra PCR-fragment.

Indien gewenst kunnen expressieniveaus ook gemakkelijk worden gemanipuleerd door primerontwerp om expressieniveaus voorspelbaar af te stemmen op ergens tussen 0,1% -50% van de meestal hoge, constitutieve expressieniveaus25. De geoptimaliseerde, multifunctionele, pABC314 afgeleide kloonvector, pABC3-XLmGFPHis26 (Figuur 1B) bevat een HRV-3C protease splitsingsplaats (X; LEVLFQ| GP), een protease die bij 4 °C beter presteert dan het veelgebruikte tabaksetsvirus (TEV) protease27. L is een vijf aminozuur (GSGGS) linker, mGFP is een monomere mutant (A206K)28,29 versie van de gist verbeterde groene fluorescentie eiwit variant yEGFP330, en His is een drie aminozuur linker (GGS) gevolgd door de zes-histidine (HHHHHH) nikkel-affiniteit eiwit zuivering tag.

Deze expressietechnologie is met succes gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen en de studie van membraaneiwitten. De eerste structuur voor een schimmelazol medicijn doelwit, S. cerevisiae Erg1131, werd opgelost met behulp van deze technologie. Het maakte ook de gedetailleerde karakterisering van C. albicans Cdr132,33,34 mogelijk en de creatie van een cysteïne-deficiënt Cdr1-molecuul35 geschikt voor cysteïne-crosslinking studies om toekomstige hoge resolutie structuur te verifiëren. Veel andere ABC-transporters van belangrijke menselijke schimmelpathogenen (d.w.z. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei en het Fusarium solani-soortencomplex) zijn ook in detail bestudeerd met behulp van dit expressieplatform24,36,37,38,39. Dit heeft de generatie mogelijk gemaakt van een paneel van S. cerevisiae-stammen die effluxpompen overexpressie geven en die zijn gebruikt in schermen met hoge doorvoer om het nieuwe fluorescerende effluxpompsubstraat Nile red40 en specifieke41 en breedspectrum14,33,42,43, 44 effluxpompremmers te ontdekken. Het gebruik van dit systeem maakte ook de ontdekking van clorgyline mogelijk als de eerste in zijn soort breedspectrum schimmel multidrug efflux pompremmer42.

Volledige oplosbaarheid van membraaneiwitten en de creatie van een homogeen membraaneiwit-micelpreparaat zonder endogene lipiden, vereist hoge detergentconcentraties45. Maar helaas inactiveert dit ook vaak het membraaneiwit5,8,45,46. De eigenschappen van detergentmonomeren en hun aggregatie in oplossing worden beïnvloed door de fysische eigenschappen van de hydrofobe staart, de lengte en vertakking van de alkylketen, de aanwezigheid van een aromatische kern of fluoroalkylzijketen of het aantal polyoxyethyleeneenheden. Detergentscreening is dus een belangrijke eerste stap om het meest geschikte reinigingsmiddel voor oplosbaarheid en zuivering van membraaneiwitten te bepalen.

C. albicans is een belangrijke menselijke schimmelpathogeen van immuungecompromitteerde personen die ernstige, levensbedreigende invasieve infecties kunnen veroorzaken47, en het kan resistent worden tegen azool antischimmelmiddelen48,49. Een van de belangrijkste mechanismen van C. albicans multidrugresistentie is de overexpressie van Cdr150, een type II ATP-bindende cassette (ABC) transporter51 van de ABCG-subfamilie in het plasmamembraan. Full-size schimmel ABCG-transporters (bestaande uit twee nucleotidebindingsdomeinen [NBD’s] en twee transmembraandomeinen [TMD’s]) zijn beter bekend als pleiotrope geneesmiddelresistentie (PDR) transporters en worden gekenmerkt door hun unieke omgekeerde domeintopologie [NBD-TMD]2. PDR-transporters komen alleen voor in planten52,53 en schimmels54. Ondanks hun belang zijn er geen structuren voor PDR-transporters, hoewel structuren voor menselijke half-size ABCG-transporters onlangs zijn opgelost, wat heeft bijgedragen aan het creëren van het eerste voorlopige model voor Cdr133. Ons recente experimentele bewijs suggereert echter dat dit model mogelijk gebrekkig is omdat schimmel PDR-transporters karakteristieke asymmetrische NBD’s hebben, wat mogelijk resulteert in een uniek transportmechanisme. Een hoge-resolutie structuur van Cdr1 is daarom nodig voor zowel het rationele ontwerp van nieuwe effluxpompremmers die kunnen helpen bij het overwinnen van efflux-gemedieerde medicijnresistentie, als om inzicht te geven in het werkingsmechanisme van deze belangrijke ABC-transporterfamilie.

Het doel van deze studie was om betrouwbare protocollen te ontwikkelen voor de expressie, oplosbaarheid en zuivering van Cdr1 in de genetisch gemodificeerde S. cerevisiae expressie gastheer, met als uiteindelijk doel het verkrijgen van een hoge resolutie structuur voor Cdr1. Als onderdeel van dit proces werd een protease-knipbare mGFPHis dubbele tag (Figuur 1B) ontworpen met een 16-residu linker die de tag scheidt van de C-terminus van Cdr1, die de binding van de bijgevoegde 6x His affiniteitstag aan de nikkel-affiniteitshars verbeterde en de monitoring van Cdr1-expressieniveaus in levende cellen en tijdens het hele zuiveringsproces mogelijk maakte. Er werd ook een reproduceerbaar protocol ontwikkeld voor kleinschalige gistplasmamembraaneiwitpreparaten met ongeveer 10% C. albicans Cdr1 (zoals geschat door Coomassie-kleuring na SDS-PAGE), dat kon worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van Cdr1.

Protocol

1. Bereiding van verse of bevroren voorraden van voor verwerking bevoegde ADΔ- en ADΔΔ-cellen Ent 25 ml 2x YPCD [d.w.z. 2x YPD; 2% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (volledig supplementmengsel)]35 medium met een enkele gistkolonie en incubateer een nacht (o/n) gedurende 16 uur bij 30 °C met schudden met 200 omwentelingen per minuut (rpm). Ent 225 ml 2x YPCD-medium met de 25 ml o/n-cultuur en controleer de optische celdichtheid bij 600…

Representative Results

Een hoge frequentie van transformatie van S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanten/μg) werd bereikt met pYES2(figuur 2B). Zoals verwacht gaf de controle zonder DNA (d.w.z. alleen ddH2O) geen transformanten en 1 μg van de lineaire CDR1-mGFPHis-transformatiecassette (figuur 1A)gaf ~ 50 transformanten(figuur 2C)met het geoptimaliseerde ADΔΔ-transformatieprotocol. De CDR1</em…

Discussion

Ondanks recente vooruitgang in de structurele analyse van membraaneiwitten, is er momenteel geen 3D-structuur voor Cdr1 of een andere PDR-transporter beschikbaar. Het verkrijgen van kennis van de Cdr1-structuur en de biochemische kenmerken ervan is dus belangrijk, omdat dit niet alleen inzicht zal geven in het rationele ontwerp van nieuwe geneesmiddelen om efflux-gemedieerde medicijnresistentie te overwinnen, maar ook in het mechanisme van functie van een belangrijke subfamilie van ABC-eiwitten.

<p class="jove_conten…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen dankbaar de financiering van het Nieuw-Zeelandse Marsden Fund (Grant UOO1305) en een blokbeurs van de Faculteit geneeskunde, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Ze willen de Universiteit van Otago bedanken voor het verstrekken van een PhD Scholarship aan G. Madani. De auteurs willen ook hun dank uitspreken aan professor Stefan Raunser en zijn collega’s, dr. Amir Apelbaum en dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, voor hun steun en supervisie tijdens een bezoek van 6 maanden aan G. Madani aan het Max Planck Instituut voor Moleculaire Fysiologie (MPIMP), Dortmund, Duitsland. De auteurs bedanken ook de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD) voor het verstrekken van een onderzoeksbeurs (57381332) aan G. Madani om de MPIMP te bezoeken.

Materials

2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S –
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. . Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins–a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Bioquímica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genética. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5′ proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D., Prasad, R. . Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. , 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Keywords: Plasma MembraneCandida AlbicansCdr1-mGFPHisMembrane ProteinSmall-scale IsolationATPaseDetergentCell HarvestingPre-cultureCell LysisCentrifugationHomogenization Buffer
check_url/pt/62592?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image