Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021

doi:

Golnoush Madani*¹, Erwin Lamping*¹, Hee Ji Lee, Masakazu Niimi², Alok K. Mitra, Richard D. Cannon

¹Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry,University of Otago, ²Department of Microbiology, Faculty of Medicine,Chulalongkorn University, ³School of Biological Sciences,University of Auckland

Summary

Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Abstract

Die erfolgreiche biochemische und biophysikalische Charakterisierung von ABC-Transportern hängt stark von der Wahl des heterologen Expressionssystems ab. In den letzten zwei Jahrzehnten haben wir eine Plattform zur Expression von Hefemembranproteinen entwickelt, mit der viele wichtige Pilzmembranproteine untersucht wurden. Der Expressionswirt Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wird in sieben großen endogenen ABC-Transportern gelöscht und enthält den Transkriptionsfaktor Pdr1-3 mit einer Gain-of-Function-Mutation, die die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteingene ermöglicht, die stabil als Einzelkopien am genomischen PDR5-Locus integriert sind. Die Erstellung vielseitiger Plasmidvektoren und die Optimierung einstufiger Klonierungsstrategien ermöglicht das schnelle und genaue Klonen, die Mutagenese und die Expression heterologer ABC-Transporter. Hier beschreiben wir die Entwicklung und Verwendung eines neuartigen proteasespaltenden mGFPHis-Doppel-Tags (d.h. des monomeren hefeverstärkten grün fluoreszierenden Proteins yEGFP3, das mit einem Sechs-Histidin-Affinitätsreinigungs-Tag verschmolzen ist), das entwickelt wurde, um eine mögliche Interferenz des Tags mit dem interessierenden Protein zu vermeiden und die Bindungseffizienz des His-Tags an Nickelaffinitätsharze zu erhöhen. Die Fusion von mGFPHis mit dem Membranprotein ORF (Open Reading Frame) ermöglicht eine einfache Quantifizierung des Proteins durch Inspektion von Polyacrylamidgelen und Nachweis von Abbauprodukten unter Beibehaltung des mGFPHis-Tags. Wir zeigen, wie diese Funktion das Waschmittel-Screening auf Membranprotein-Solubilisierung erleichtert. Ein Protokoll zur effizienten, schnellen und zuverlässigen Isolierung der kleinräumigen Plasmamembranpräparate des C-terminal markierten Candida albicans Multidrug-Efflux-Transporters Cdr1, überexprimiert in S. cerevisiae ADΔΔ, wird vorgestellt. Dieses kleine Plasmamembran-Isolationsprotokoll erzeugt innerhalb eines einzigen Arbeitstages hochwertige Plasmamembranen. Die Plasmamembranpräparate können verwendet werden, um die Enzymaktivitäten von Cdr1- und Cdr1-Mutantenvarianten zu bestimmen.

Introduction

Die Extraktion integraler Membranproteine aus ihrer nativen Lipidumgebung kann ihre Struktur und Funktion dramatisch beeinflussen¹^,²^,³^,⁴. Die komplexe Lipidzusammensetzung biologischer Membranen⁵ sorgt dafür, dass kritisch wichtige Protein-Lipid-Interaktionen auftreten können⁶. Lipide erhalten die strukturelle Integrität von Membranproteinen und ermöglichen es ihnen so, in ihrem Membrankompartiment-Ziel(e) korrekt zu funktionieren⁷^,⁸. Daher ist ein kritischer erster Schritt bei der Reinigung des Membranproteins die Extraktion des Proteins aus seiner nativen Umgebung, ohne seine Struktur und / oder Funktion zu beeinträchtigen.

Es gibt viele Hindernisse für die Charakterisierung der Struktur von Membranproteinen, von denen die meisten mit ihrer hydrophoben Natur zusammenhängen, und die Schwierigkeiten, richtig gefaltete und funktionelle Membranproteine in den Mengen zu exprimieren, die für die Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erforderlich sind⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Es gibt drei Arten von Membranproteinexpressionssystemen: homologe⁹, heterologe¹³^,¹⁴^,¹⁵und in vitro Expressionssysteme ¹⁶^,¹⁷. Die oft niedrigen Expressionsniveaus oder die unerschwinglichen Kosten vieler Expressionssysteme lassen nur wenige Wirte als bevorzugte Option zur Herstellung von Membranproteinen. Dazu gehören der bakterielle Wirt Escherichia coli,die Hefen S. cerevisiae und Pichia pastorissowie höhere Eukaryoten wie Sf9-Insektenzellen oder Säugetierzelllinien^18. Alle Membranproteinexpressionstechnologien haben Vor- und Nachteile; S. cerevisiae ist jedoch vielleicht der am besten untersuchte eukaryotische Modellorganismus, der für die Membranproteinproduktion geeignet ist. Es ist sehr vielseitig mit Anwendungen in der Gentechnik, Wirkstoffforschung, synthetischen Biologie und der Expression von eukaryotischen Membranproteinen¹⁴^,¹⁹^,²⁰^,²¹.

In dieser Studie wurde eine patentierte S. cerevisiae Membranproteinexpressionstechnologie²¹ verwendet, mit S. cerevisiae ADΔ¹⁴ und ADΔΔ²² als bevorzugte Wirte (Abbildung 1A), um die Haupt-C. albicans Multidrug-Effluxpumpe Cdr1 zu überexprimieren und zu untersuchen. Beide S. cerevisiae-Stämme sind Derivate von AD1-8u^–^23, bei denen entweder das ura3 (ADΔ) oder sowohl das ura3- als auch das his1-Gen (ADΔΔ) gelöscht wurden, um falsch positive Uracil- oder Histidin-Prototroph-Transformanten zu eliminieren, die durch die unerwünschte Integration an den genomischen Loci URA3 oder HIS1 entstehen. Die In Abbildung 1Adargestellte Löschung der 7 wichtigsten Multidrug-Effluxpumpen²³macht ADΔΔ exquisit empfindlich gegenüber den meisten Xenobiotika. Der Gain-of-Function-Mutanten-Transkriptionsfaktor Pdr1-3 bewirkt die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteine wie Cdr1 (rote Achtecke in Abbildung 1A)nach Integration der heterolog-ORF-haltigen Transformationskassette (Abbildung 1A) am genomischen PDR5-Locus (blaues Rechteck in Abbildung 1A)über zwei homologe Rekombinationsereignisse. Die korrekte Plasmamembranlokalisierung von C-terminal mGFPHis markierten Proteinen kann durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden (Abbildung 1A), und das His-Tag kann zur Nickelaffinitätsreinigung des markierten Proteins verwendet werden. Das Klonen einiger Pilz-ABC-Transporter (z.B. Candida krusei ABC1)in pABC3-abgeleitete Plasmide war jedoch nicht möglich, da sie aufgrund der Zelltoxizität nicht in Escherichia coli vermehrt werden konnten. Dies führte zur Entwicklung des einstufigen Klonens von Membranproteinen¹⁴,^24, die entweder an ihrem N- oder C-Terminus mit verschiedenen Affinitäts-, Epitop- oder Reporter-Tags direkt in S. cerevisiae ADΔΔ markiert sind (Abbildung 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-Stämme, die verschiedene CDR1-Mutanten überexprimieren, können auf diese Weise auch effizient erzeugt werden, indem bis zu fünf einzelne PCR-Fragmente verwendet werden, die sich um 25 bp überlappen (Abbildung 1C). Mit diesem Protokoll können viele ORFs von Interesse zu niedrigen Kosten und mit hoher Effizienz innerhalb kürzester Zeit geklont, ausgedrückt und charakterisiert werden. Die Transformationseffizienz reduziert sich mit jedem zusätzlichen PCR-Fragment nur ~2-fach.

Falls gewünscht, können Ausdrucksebenen auch leicht durch Primer-Design manipuliert werden, um die Ausdruckspegel vorhersehbar auf 0,1% bis 50% der normalerweise hohen, konstitutiven Ausdrucksstufen²⁵zu optimieren. Der optimierte, multifunktionale, pABC3¹⁴ derivative Klonierungsvektor, pABC3-XLmGFPHis²⁶ (Abbildung 1B) enthält eine HRV-3C-Protease-Spaltungsstelle (X; LEVLFQ| GP), eine Protease, die bei 4 °C besser abschneidet als die häufig verwendete Tabakätzvirus (TEV) Protease²⁷. L ist ein Linker mit fünf Aminosäuren (GSGGS), mGFP ist eine monomere Mutante (A206K)²⁸^,²⁹ Version der hefeverstärkten Grünfluoreszenzproteinvariante yEGFP3³⁰, und His ist ein Drei-Aminosäure-Linker (GGS), gefolgt von der Sechs-Histidin (HHHHHH) Nickelaffinität Proteinreinigungsmarkierung.

Diese Expressionstechnologie wurde erfolgreich in der Wirkstoffforschung und der Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt. Die erste Struktur für ein Pilzazol-Wirkstoffziel, S. cerevisiae Erg11³¹, wurde mit dieser Technologie gelöst. Es ermöglichte auch die detaillierte Charakterisierung von C. albicans Cdr1³²^,³³^,³⁴ und die Schaffung eines Cystein-defizienten Cdr1-Moleküls^35, das für Cystein-Vernetzungsstudien geeignet ist, um jede zukünftige hochauflösende Struktur zu verifizieren. Viele andere ABC-Transporter von wichtigen menschlichen Pilzerregern (z. B. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei und der Fusarium solani-Artenkomplex) wurden ebenfalls ausführlich mit dieser Expressionsplattform²⁴^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹untersucht. Dies hat die Erzeugung eines Panels von S. cerevisiae-Stämmen ermöglicht, die Überflusspumpen überexprimieren, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen verwendet^wurden,um das neuartige fluoreszierende Effluxpumpensubstrat Nilrot⁴⁰ und spezifische⁴¹ und Breitbandpumpeninhibitoren^14,^33,^{42, 43,}⁴⁴ zu entdecken. Die Verwendung dieses Systems ermöglichte auch die Entdeckung von Clorgylin als erstem seiner Art Breitband-Pilz-Multidrug-Effluxpumpen-Inhibitor⁴².

Die vollständige Solubilisierung von Membranproteinen und die Schaffung einer homogenen Membranprotein-Mizellen-Zubereitung ohne endogene Lipide erfordert hohe Waschmittelkonzentrationen⁴⁵. Leider inaktiviert dadurch aber auch oft das Membranprotein⁵^,⁸^,⁴⁵^,⁴⁶. Die Eigenschaften von Waschmittelmonomeren und ihre Aggregation in Lösung werden durch die physikalischen Eigenschaften des hydrophoben Schwanzes, die Länge und Verzweigung der Alkylkette, das Vorhandensein eines aromatischen Kerns oder einer Fluoralkylseitenkette oder die Anzahl der Polyoxyethyleneinheiten beeinflusst. Daher ist das Waschmittel-Screening ein wichtiger erster Schritt, um das am besten geeignete Reinigungsmittel für die Membranprotein-Solubilisierung und -reinigung zu bestimmen.

C. albicans ist ein wichtiger menschlicher Pilzerreger immungeschwächter Personen, der schwere, lebensbedrohliche invasive Infektionen verursachen kann⁴⁷, und es kann resistent gegen Azol-Antimykotika werden⁴⁸^,⁴⁹. Einer der Hauptmechanismen der Multidrug-Resistenz von C. albicans ist die Überexpression von Cdr1⁵⁰, einem Typ II ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC)⁵¹ der ABCG-Unterfamilie, der sich in der Plasmamembran befindet. ABCG-Pilztransporter in voller Größe (bestehend aus zwei Nukleotidbindungsdomänen [NBDs] und zwei Transmembrandomänen [TMDs]) sind häufiger als pleiotrope Arzneimittelresistenztransporter (PDR) bekannt und zeichnen sich durch ihre einzigartige invertierte Domänentopologie [NBD-TMD]_{2 aus.} PDR-Transporter kommen nur in Pflanzen⁵²^,⁵³ und Pilzen^{54 vor.} Trotz ihrer Bedeutung gibt es keine Strukturen für PDR-Transporter, obwohl Strukturen für menschliche ABCG-Transporter mittlerer Größe kürzlich gelöst wurden, was dazu beigetragen hat, das erste vorläufige Modell für Cdr1³³zu erstellen. Unsere jüngsten experimentellen Beweise deuten jedoch darauf hin, dass dieses Modell fehlerhaft ist, möglicherweise weil Pilz-PDR-Transporter charakteristische asymmetrische NBDs haben, was möglicherweise zu einem einzigartigen Transportmechanismus führt. Eine hochauflösende Struktur von Cdr1 ist daher sowohl für das rationale Design neuartiger Effluxpumpeninhibitoren erforderlich, die helfen können, effluxvermittelte Arzneimittelresistenzen zu überwinden, als auch um Einblicke in den Wirkmechanismus dieser wichtigen ABC-Transporterfamilie zu geben.

Ziel dieser Studie war es, zuverlässige Protokolle für die Expression, Solubilisierung und Reinigung von Cdr1 im genetisch veränderten Expressionswirt S. cerevisiae zu entwickeln, mit dem ultimativen Ziel, eine hochauflösende Struktur für Cdr1 zu erhalten. Im Rahmen dieses Prozesses wurde ein proteasespalter mGFPHis-Doppel-Tag (Abbildung 1B) mit einem 16-Rückstands-Linker entwickelt, der den Tag vom C-Terminus von Cdr1 trennt, was die Bindung des angehängten 6x His-Affinitäts-Tags an das Nickelaffinitätsharz verbesserte und die Überwachung der Cdr1-Expressionsniveaus in lebenden Zellen und während des gesamten Reinigungsprozesses ermöglichte. Es wurde auch ein reproduzierbares Protokoll für kleine Hefeplasmamembranproteinpräparate mit etwa 10% C. albicans Cdr1 (wie von Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE geschätzt) entwickelt, das für die biochemische Charakterisierung von Cdr1 verwendet werden könnte.

Protocol

1. Herstellung von frischen oder gefrorenen Umwandlungsbeständen kompetenter ADΔ- und ADΔΔ-Zellen 25 ml 2x YPCD [d.h. 2x YPD; 2% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 4% (w/v) Dextrose, 0,079% (w/v) CSM (komplette Ergänzungsmischung)]35 Medium mit einer einzigen Hefekolonie bei impfen und über Nacht (o/n) für 16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren. Impfen Sie 225 ml 2x YPCD-Medium mit der 25 mL o/n-Kultur und überprüfen Sie die o…

Representative Results

Eine hohe Transformationsfrequenz von S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 Transformanten/μg) wurde mit pYES2 erreicht (Abbildung 2B). Wie erwartet, ergab die No-DNA-Kontrolle (d.h. nur ddH2O) keine Transformanten, und 1 μg der linearen CDR1-mGFPHis Transformationskassette (Abbildung 1A) ergab ~ 50 Transformanten (Abbildung 2C) mit dem optimierten ADΔΔ-Transformationsprotokoll. Die …

Discussion

Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Strukturanalyse von Membranproteinen ist derzeit keine 3D-Struktur für Cdr1 oder einen anderen PDR-Transporter verfügbar. Daher ist es wichtig, Kenntnisse über die Cdr1-Struktur und ihre biochemischen Eigenschaften zu gewinnen, da dies nicht nur Einblicke in das rationale Design neuartiger Medikamente zur Überwindung von effluxvermittelter Arzneimittelresistenz geben wird, sondern auch in den Funktionsmechanismus einer wichtigen Unterfamilie von ABC-Proteinen.

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Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der Finanzierung durch den New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) und einem Blockzuschuss der Medizinischen Fakultät der Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Sie danken der University of Otago für die Bereitstellung eines Promotionsstipendiums für G. Madani. Die Autoren danken auch Professor Stefan Raunser und seinen Kollegen Dr. Amir Apelbaum und Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam für ihre Unterstützung und Betreuung während eines 6-monatigen Besuchs von G. Madani am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie (MPIMP), Dortmund, Deutschland. Die Autoren danken auch dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) für die Bereitstellung eines Forschungsstipendiums (57381332) für den Besuch des MPIMP durch G. Madani.

Materials

2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)	Merck	77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside	Anatrace	NG310S	LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside	Anatrace	NG311S	OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside	Anatrace	NG322S	DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside	Glycon Biochemicals GmbH	D99019-C	PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)	Bio-Rad	1610148
Acetic acid (glacial)	Merck	64-19-7
Agar	Formedium	009002-18-0
Ammonium molybdate	Sigma-Aldrich	13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)	Bio-Rad	1610700
ATP disodium salt	sigma-Aldrich	A-6419
Bromophenol blue	SERVA Electrophoresis GmbH	34725-61-6
CHAPS	Anatrace	C316S
CHAPSO	Anatrace	C317S
CSM	Formedium	DCS0019
CSM minus uracil	Formedium	DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	C324S	CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	C327S	CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	C321S	CYMAL-1
Digitonin	Sigma-Aldrich	11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)	Roche Diagnostics	10197785103
DMSO	Merck	67-68-5
Ethanol	Merck	459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)	Merck	6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent	Applied Biosystems	78205	A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose	Formedium	50-99-7
Glycerol	Merck	56-81-5
Glycine	Merck	G8898
HEPES	Formedium	7365-45-9
Hydrochloric acid	Merck	1003172510
KOD Fx Neo	TOYOBO Co	KFX-201	Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)	Sigma-Aldrich	546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate	sigma-Aldrich	M2393
MES	Formedium	145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide	Anatrace	H110S	HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide	Anatrace	M320S	MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine	Anatrace	F304S	Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D322S	DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate	Anatrace	AZ312S	Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide	Anatrace	D360S	LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside	Anatrace	D310HA	α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310S	β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	N330S	NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate	Anatrace	AZ318S	Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate	Anatrace	AZ308S	Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine	Anatrace	F300S	Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside	Anatrace	O311S	OG
n-Tetradecyl-phosphocholine	Anatrace	F312S	Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	T315S	TDM
n-Tridecyl-phosphocholine	Anatrace	F310S	Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	T323S	–
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	U300S	UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol	Sigma-Aldrich	9002-93-1	TRITON X-100
Oligomycin	Sigma-Aldrich	75351
Peptone	Formedium	3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Diagnostics	329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase	New England Biolabs	M0535S	High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)	Sigma-Aldrich	25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate	Sigma-Aldrich	9005-65-6	TWEEN 80
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P8394
Protein Assay Kit	Bio-Rad	5000122	RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain	Bio-Rad	1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)	Abcam	AB116028
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289
Sodium dodecyl sulphate	Sigma-Aldrich	151-21-3	SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra	Sigma-Aldrich	11140
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350S	DDS
Sulphuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Yeast extract	Formedium	008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids	Formedium	CYN0402
Equipment (type)
Centrifuge (Eppendorf 5804)	Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)	Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)	Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)	Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)	Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)	BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)	Bio-Rad
Power supply (PowerPac)	Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)	Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)	Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)	Amersham BioSciences UK Ltd

Referências

Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
Luckey, M. . Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , 69-105 (2014).
Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins–a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Bioquímica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , (2002).
Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genética. 205 (4), 1619-1639 (2017).
Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5′ proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, 878-882 (2012).
Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, 303-311 (1997).
Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, 89-94 (1996).
Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D., Prasad, R. . Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. , 379-406 (2017).
Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

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Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).