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Biologia

Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021
doi:
10.3791/62592
, , , , ,
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry,University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine,Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences,University of Auckland

Summary

Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.

Abstract

El éxito de la caracterización bioquímica y biofísica de los transportadores ABC depende en gran medida de la elección del sistema de expresión heteróloga. En las últimas dos décadas, hemos desarrollado una plataforma de expresión de proteínas de membrana de levadura que se ha utilizado para estudiar muchas proteínas importantes de membrana fúngica. El huésped de expresión Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ se elimina en siete transportadores ABC endógenos principales y contiene el factor de transcripción Pdr1-3 con una mutación de ganancia de función que permite la sobreexpresión constitutiva de genes de proteínas de membrana heterólogas integradas de manera estable como copias individuales en el locus genómico PDR5. La creación de vectores plásmidos versátiles y la optimización de estrategias de clonación en un solo paso permiten la clonación, mutagénesis y expresión rápidas y precisas de transportadores ABC heterólogos. Aquí, describimos el desarrollo y el uso de una nueva etiqueta doble mGFPHis escindible con proteasa (es decir, la proteína fluorescente verde mejorada con levadura monomérica yEGFP3 fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad de seis histidinas) que fue diseñada para evitar la posible interferencia de la etiqueta con la proteína de interés y para aumentar la eficiencia de unión de la etiqueta His a las resinas de afinidad de níquel. La fusión de mGFPHis a la proteína de membrana ORF (marco de lectura abierto) permite una fácil cuantificación de la proteína mediante la inspección de geles de poliacrilamida y la detección de productos de degradación conservando la etiqueta mGFPHis. Demostramos cómo esta característica facilita el cribado con detergente para la solubilización de proteínas de membrana. Se presenta un protocolo para el aislamiento eficiente, rápido y confiable de las preparaciones de membrana plasmática a pequeña escala del transportador de eflujo multifármaco Cdr1 marcado con C-terminalmente marcado como Candida albicans Cdr1 sobreexpresado en S. cerevisiae ADΔΔ. Este protocolo de aislamiento de membranas plasmáticas a pequeña escala genera membranas plasmáticas de alta calidad en un solo día laborable. Las preparaciones de membrana plasmática se pueden utilizar para determinar las actividades enzimáticas de las variantes mutantes Cdr1 y Cdr1.

Introduction

La extracción de proteínas de membrana integral de su entorno lipídico nativo puede afectar dramáticamente su estructura y función1,2,3,4. La compleja composición lipídica de las membranas biológicas5 asegura que puedan ocurrir interacciones proteína-lípido de importancia crítica6. Los lípidos mantienen la integridad estructural de las proteínas de membrana, lo que les permite funcionar correctamente en su(s) destino(s) compartimental(es) de membrana7,8. Por lo tanto, un primer paso crítico en la purificación de proteínas de membrana es la extracción de la proteína de su entorno nativo sin afectar su estructura y / o función.

Existen muchos obstáculos para caracterizar la estructura de las proteínas de membrana, la mayoría de los cuales están relacionados con su naturaleza hidrofóbica, y las dificultades de expresar proteínas de membrana correctamente plegadas y funcionales en las cantidades requeridas para la cristalografía de rayos X o la microscopía crio-electrónica (crio-EM)9,10,11,12. Existen tres tipos de sistemas de expresión de proteínas de membrana:homólogos 9,heterólogos13,14,15y sistemas de expresión in vitro 16,17. Los niveles de expresión a menudo bajos, o los costos prohibitivos, de muchos sistemas de expresión dejan solo unos pocos huéspedes como la opción preferida para producir proteínas de membrana. Incluyen el huésped bacteriano, Escherichia coli,las levaduras S. cerevisiae y Pichia pastoris,y eucariotas superiores como las células de insectos Sf9 o las líneas celulares de mamíferos18. Todas las tecnologías de expresión de proteínas de membrana tienen ventajas y desventajas; sin embargo, S. cerevisiae es quizás el organismo modelo eucariota mejor estudiado adecuado para la producción de proteínas de membrana. Es altamente versátil con aplicaciones en ingeniería genética, descubrimiento de fármacos, biología sintética y la expresión de proteínas de membrana eucariota14,19,20,21.

En este estudio, se utilizó una tecnología patentada de expresión de proteínas de membrana S. cerevisiae 21, con S. cerevisiae ADΔ14 y ADΔΔ22 como los huéspedes preferidos(Figura 1A),para sobreexpresar y estudiar la principal bomba de eflujo multifármaco de C. albicans Cdr1. Ambas cepas de S. cerevisiae son derivados de AD1-8u–23 que tienen los genes ura3 (ADΔ) o ura3 e his1 (ADΔΔ) eliminados para eliminar cualquier falso positivo de uracilo o prototrofo de histidina que surja a través de la integración no deseada en los loci genómicos URA3 o HIS1. La eliminación de las 7 principales bombas de eflujo multifármaco23,indicadas en la Figura 1A, hace que ADΔΔ sea exquisitamente sensible a la mayoría de los xenobióticos. El factor de transcripción mutante de ganancia de función Pdr1-3 causa la sobreexpresión constitutiva de proteínas de membrana heterólogas como Cdr1 (octógonos rojos en la Figura 1A)después de la integración del casete de transformación heterólogo-ORF -contiene (Figura 1A) en el locus genómico PDR5 (rectángulo azul en la Figura 1A) a través de dos eventos de recombinación homólogos. La localización adecuada de la membrana plasmática de las proteínas marcadas con C-terminal mGFPHis se puede confirmar mediante microscopía confocal(Figura 1A),y la etiqueta His se puede utilizar para la purificación de afinidad de níquel de la proteína marcada. Sin embargo, la clonación de algunos transportadores de ABC fúngicos (por ejemplo, Candida krusei ABC1)en plásmidos derivados de pABC3 no fue posible porque no pudieron propagarse en Escherichia coli debido a la toxicidad celular. Esto provocó el desarrollo de la clonación de un solo paso de proteínas de membrana14,24 etiquetadas en su terminal N o C con varias etiquetas de afinidad, epítopo o reportero directamente en S. cerevisiae ADΔΔ(Figura 1C). S. cerevisiae Las cepas ADΔΔ que sobreexpresan varios mutantes CDR1 también se pueden crear de manera eficiente mediante el uso de hasta cinco fragmentos individuales de PCR que se superponen en 25 pb(Figura 1C). Empleando este protocolo, muchos ORF de interés pueden ser clonados, expresados y caracterizados a bajo costo y con alta eficiencia en un lapso de tiempo muy corto. La eficiencia de transformación se reduce solo ~ 2 veces con cada fragmento de PCR adicional. 

Si se desea, los niveles de expresión también pueden manipularse fácilmente mediante el diseño de imprimación para ajustar de manera predecible los niveles de expresión a cualquier lugar entre el 0,1% y el 50% de los niveles de expresión constitutiva generalmente altos25. El vector de clonación derivado pABC314 optimizado, multifuncional, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contiene un sitio de escisión de la proteasa HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), una proteasa que funciona mejor a 4 °C que la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) de uso frecuente27. L es un enlazador de cinco aminoácidos (GSGGS), mGFP es un mutante monomérico (A206K)28,29 versión de la variante de proteína de fluorescencia verde mejorada por levadura yEGFP330,y el suyo es un enlazador de tres aminoácidos (GGS) seguido de la etiqueta de purificación de proteína de afinidad de níquel de seis histidinas (HHHHHH).

Esta tecnología de expresión se ha utilizado con éxito en el descubrimiento de fármacos y el estudio de proteínas de membrana. La primera estructura para un fármaco azol fúngico diana, S. cerevisiae Erg1131, se resolvió utilizando esta tecnología. También permitió la caracterización detallada de C. albicans Cdr132 , 33,34y la creación de una molécula de Cdr1 deficiente en cisteína35 adecuada para estudios de reticulación de cisteína para verificar cualquier estructura futura de alta resolución. Muchos otros transportadores ABC de los principales patógenos fúngicos humanos (es decir, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei y el complejo de especies Fusarium solani) también se han estudiado en detalle utilizando esta plataforma de expresión24,36,37,38,39. Esto ha permitido la generación de un panel de cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan bombas de eflujo que se ha utilizado en pantallas de alto rendimiento para descubrir el nuevo sustrato de bomba de eflujo fluorescente Rojo del Nilorojo 40 y específico41 y de amplio espectro14,33,42,43,44 inhibidores de la bomba de eflujo. El uso de este sistema también permitió el descubrimiento de la clorgirina como el primer inhibidor de la bomba de eflujo multifármaco fúngico de amplio espectro de su tipo42.

La solubilización completa de las proteínas de membrana y la creación de una preparación homogénea de proteína-micela de membrana desprovista de lípidos endógenos, requiere altas concentraciones de detergente45. Pero desafortunadamente, esto también a menudo inactiva la proteína de membrana5,8,45,46. Las propiedades de los monómeros detergentes y su agregación en solución se ven afectadas por las propiedades físicas de la cola hidrofóbica, la longitud y ramificación de la cadena alquilo, la presencia de un núcleo aromático o cadena lateral de fluoroalquilo, o el número de unidades de polioxietileno. Por lo tanto, el cribado de detergente es un primer paso importante para determinar el detergente más adecuado para la solubilización y purificación de proteínas de membrana.

C. albicans es un importante patógeno fúngico humano de individuos inmunocomprometidos que puede causar infecciones invasivas graves y potencialmente mortales47, y puede volverse resistente a los medicamentos antimicóticos azoles48,49. Uno de los principales mecanismos de la resistencia a múltiples medicamentos de C. albicans es la sobreexpresión de Cdr150,que es untransportador de casete de unión a ATP (ABC) tipo II de la subfamilia ABCG ubicado en la membrana plasmática. Los transportadores ABCG fúngicos de tamaño completo (que consisten en dos dominios de unión a nucleótidos [NBD] y dos dominios transmembrana [TMD]) se conocen más comúnmente como transportadores de resistencia a medicamentos pleiotrópicos (PDR) y se caracterizan por su topología única de dominio invertido [NBD-TMD]2. Los transportadores PDR solo se encuentran en las plantas52,53 y hongos54. A pesar de su importancia, no hay estructuras para los transportadores PDR, aunque recientemente se han resuelto estructuras para transportadores ABCG humanos de tamaño medio, lo que ayudó a crear el primer modelo tentativo para Cdr133. Nuestra evidencia experimental reciente sugiere, sin embargo, que este modelo es defectuoso posiblemente porque los transportadores de PDR de hongos tienen NBD asimétricos característicos que resultan muy posiblemente en un mecanismo de transporte único. Por lo tanto, se requiere una estructura de alta resolución de Cdr1 tanto para el diseño racional de nuevos inhibidores de la bomba de eflujo que puedan ayudar a superar la resistencia a los medicamentos mediados por el eflujo, como para proporcionar información sobre el mecanismo de acción de esta importante familia de transportadores ABC.

El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos fiables para la expresión, solubilización y purificación de Cdr1 en el huésped de expresión de S. cerevisiae modificado genéticamente, con el objetivo final de obtener una estructura de alta resolución para Cdr1. Como parte de este proceso, se diseñó una doble etiqueta mGFPHis escindible con proteasa(Figura 1B)con un enlazador de 16 residuos que separa la etiqueta del extremo C de Cdr1, lo que mejoró la unión de la etiqueta de afinidad 6x His adjunta a la resina de afinidad de níquel y permitió el monitoreo de los niveles de expresión de Cdr1 en células vivas y durante todo el proceso de purificación. También se desarrolló un protocolo reproducible para preparaciones de proteínas de membrana plasmática de levadura a pequeña escala que contienen aproximadamente un 10% de C. albicans Cdr1 (según lo estimado por la tinción de Coomassie después de SDS-PAGE), que podría usarse para la caracterización bioquímica de Cdr1.

Protocol

1. Preparación de existencias frescas o congeladas de células ADΔ y ADΔΔ competentes para la transformación Inocular 25 ml de 2x YPCD [es decir, 2x YPD; 2% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 4% (p/v) dextrosa), 0,079 % (p/v) CSM (mezcla completa de suplemento)]35 medio con una sola colonia de levadura e incubar durante la noche (o/n) durante 16 h a 30 °C con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm). Inocular 225 mL de 2x medio YPCD con el cultivo d…

Representative Results

Se logró una alta frecuencia de transformación de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x10 4 transformadores/μg) con pYES2(Figura 2B). Como era de esperar, el control sin ADN (es decir, ddH2O solamente) no dio transformadores, y 1 μg del casete de transformación lineal CDR1-mGFPHis (Figura 1A)dio ~ 50 transformadores(Figura 2C)con el protocolo de transformación ADΔΔ optimizado. Los transf…

Discussion

A pesar del progreso reciente en el análisis estructural de proteínas de membrana, actualmente no se dispone de una estructura 3D para Cdr1, o cualquier otro transportador PDR. Por lo tanto, obtener conocimiento de la estructura de Cdr1 y sus características bioquímicas es importante, ya que esto no solo proporcionará información sobre el diseño racional de nuevos medicamentos para superar la resistencia a los medicamentos mediada por el eflujo, sino también sobre el mecanismo de función de una importante subfam…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen la financiación del Fondo Marsden de Nueva Zelanda (Subvención UOO1305), y una subvención en bloque de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia (M. Niimi). Desean agradecer a la Universidad de Otago por proporcionar a G. Madani una beca de doctorado. Los autores también desean expresar su gratitud al profesor Stefan Raunser y sus colegas, el Dr. Amir Apelbaum y el Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por su apoyo y supervisión durante una visita de 6 meses de G. Madani al Instituto Max Planck de Fisiología Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemania. Los autores también agradecen al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) por proporcionar a G. Madani una beca de investigación (57381332) para visitar el MPIMP.

Materials

2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S –
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd
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Referências

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Keywords: Plasma MembraneCandida AlbicansCdr1-mGFPHisMembrane ProteinSmall-scale IsolationATPaseDetergentCell HarvestingPre-cultureCell LysisCentrifugationHomogenization Buffer
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Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).
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