Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis
Summary
Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.
Abstract
Le succès de la caractérisation biochimique et biophysique des transporteurs ABC dépend fortement du choix du système d’expression hétérologue. Au cours des deux dernières décennies, nous avons développé une plateforme d’expression des protéines membranaires de levure qui a été utilisée pour étudier de nombreuses protéines membranaires fongiques importantes. L’expression hôte Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ est supprimée dans sept principaux transporteurs ABC endogènes et contient le facteur de transcription Pdr1-3 avec une mutation de gain de fonction qui permet la surexpression constitutive de gènes protéiques membranaires hétérologues intégrés de manière stable sous forme de copies uniques au locus génomique PDR5. La création de vecteurs plasmidiques polyvalents et l’optimisation de stratégies de clonage en une seule étape permettent le clonage, la mutagénèse et l’expression rapides et précis de transporteurs ABC hétérologues. Ici, nous décrivons le développement et l’utilisation d’une nouvelle double étiquette mGFPHis clivée par la protéase (c’est-à-dire la protéine fluorescente verte améliorée par levure monomère yEGFP3 fusionnée à une étiquette de purification d’affinité à six histidines) qui a été conçue pour éviter toute interférence possible de la balise avec la protéine d’intérêt et pour augmenter l’efficacité de liaison de la balise His aux résines d’affinité nickel. La fusion de mGFPHis à la protéine membranaire ORF (cadre de lecture ouvert) permet une quantification facile de la protéine par inspection de gels de polyacrylamide et détection de produits de dégradation conservant la balise mGFPHis. Nous démontrons comment cette caractéristique facilite le criblage des détergents pour la solubilisation des protéines membranaires. Un protocole pour l’isolation efficace, rapide et fiable des préparations de membrane plasmique à petite échelle du transporteur d’efflux multimédicament Candida albicans Cdr1 surexprimant dans S. cerevisiae ADΔΔ, marqué en C-terminal, est présenté. Ce protocole d’isolation des membranes plasmiques à petite échelle génère des membranes plasmiques de haute qualité en une seule journée de travail. Les préparations de membrane plasmique peuvent être utilisées pour déterminer les activités enzymatiques des variantes mutantes Cdr1 et Cdr1.
Introduction
L’extraction des protéines membranaires intégrales de leur environnement lipidique natif peut affecter considérablement leur structure et leur fonction1,2,3,4. La composition lipidique complexe des membranes biologiques5 garantit que des interactions protéine-lipide d’importance critique peuvent se produire6. Les lipides maintiennent l’intégrité structurelle des protéines membranaires, leur permettant ainsi de fonctionner correctement dans leur(s) compartiment(s) membranaire(s) destination(s)7,8. Par conséquent, une première étape critique dans la purification de la protéine membranaire est l’extraction de la protéine de son environnement natif sans affecter sa structure et / ou sa fonction.
Il existe de nombreux obstacles à la caractérisation de la structure des protéines membranaires, dont la plupart sont liés à leur nature hydrophobe, et aux difficultés d’expression de protéines membranaires correctement repliées et fonctionnelles dans les quantités requises pour la cristallographie aux rayons X ou la cryo-microscopie électronique (cryo-EM)9,10,11,12. Il existe trois types de systèmes d’expression des protéines membranaires :homologues 9, hétérologues13,14,15et systèmes d’expression in vitro 16,17. Les niveaux d’expression souvent faibles, ou les coûts prohibitifs, de nombreux systèmes d’expression ne laissent que quelques hôtes comme option préférée pour produire des protéines membranaires. Ils comprennent l’hôte bactérien, Escherichia coli, les levures S. cerevisiae et Pichia pastoris, et les eucaryotes supérieurs tels que les cellules d’insectes Sf9 ou les lignées cellulaires de mammifères18. Toutes les technologies d’expression des protéines membranaires présentent des avantages et des inconvénients; cependant, S. cerevisiae est peut-être l’organisme modèle eucaryote le mieux étudié adapté à la production de protéines membranaires. Il est très polyvalent avec des applications dans le génie génétique, la découverte de médicaments, la biologie synthétique et l’expression des protéines de la membrane eucaryote14,19,20,21.
Dans cette étude, une technologie brevetée d’expression des protéines membranaires S. cerevisiae 21 a été utilisée, avec S. cerevisiae ADΔ14 et ADΔΔ22 comme hôtes préférés(Figure 1A),pour surexprimer et étudier la principale pompe d’efflux multimédicament C. albicans Cdr1. Les deux souches de S. cerevisiae sont des dérivés de AD1-8u– 23 qui ont soit les gènes ura3 (ADΔ) ou les gènes ura3 et his1 (ADΔΔ) supprimés pour éliminer tout transformant prototrophe uracile ou histidine faussement positif résultant de l’intégration indésirable aux loci génomiques URA3 ou HIS1. La suppression des 7 principales pompes d’efflux multidrogue23, indiquée à la figure 1A, rend ADΔΔ extrêmement sensible à la plupart des xénobiotiques. Le facteur de transcription mutant de gain de fonction Pdr1-3 provoque la surexpression constitutive de protéines membranaires hétérologues telles que Cdr1 (octogones rouges dans la figure 1A)après intégration de la cassette de transformation hétérologue contenant de l’ORF(Figure 1A)au locus génomique PDR5 (rectangle bleu dans la figure 1A)via deux événements de recombinaison homologue. La localisation correcte de la membrane plasmique des protéines marquées mGFPHis C-terminale peut être confirmée par microscopie confocale(Figure 1A),et l’étiquette His peut être utilisée pour la purification par affinité nickel de la protéine marquée. Le clonage de certains transporteurs fongiques ABC (p. ex. Candida krusei ABC1)en plasmides dérivés de pABC3 n’a toutefois pas été possible car ils n’ont pas pu être propagés dans Escherichia coli en raison de la toxicité cellulaire. Cela a incité au développement du clonage en une étape des protéines membranaires14,24 marquées à leur terminus N ou C avec diverses étiquettes d’affinité, d’épitope ou de rapporteur directement dans S. cerevisiae ADΔΔ ( Figure1C). S. cerevisiae Les souches ADΔΔ surexprimant divers mutants CDR1 peuvent également être créées efficacement de cette manière en utilisant jusqu’à cinq fragments PCR individuels qui se chevauchent de 25 pb(Figure 1C). En utilisant ce protocole, de nombreux ORF d’intérêt peuvent être clonés, exprimés et caractérisés à faible coût et à haute efficacité dans un laps de temps très court. L’efficacité de la transformation ne diminue que d’environ 2 fois à chaque fragment de PCR supplémentaire.
Si vous le souhaitez, les niveaux d’expression peuvent également être facilement manipulés par la conception de l’amorce pour régler de manière prévisible les niveaux d’expression entre 0,1% et 50% des niveaux d’expression constitutifs généralement élevés25. Le vecteur de clonage dérivé optimisé et multifonctionnel pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Figure 1B)contient un site de clivage de la protéase HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), une protéase qui fonctionne mieux à 4 °C que la protéase27du virus de la gravure du tabac (TEV) fréquemment utilisée. L est un linker à cinq acides aminés (GSGGS), mGFP est un mutant monomère (A206K)28,version 29 de la variante de protéine de fluorescence verte améliorée de levure yEGFP330, et His est un linker à trois acides aminés (GGS) suivi de la balise de purification de la protéine d’affinité nickel à six histidine (HHHHHH).
Cette technologie d’expression a été utilisée avec succès dans la découverte de médicaments et l’étude des protéines membranaires. La première structure d’une cible fongique de médicament azole, S. cerevisiae Erg1131, a été résolue à l’aide de cette technologie. Il a également permis la caractérisation détaillée de C. albicans Cdr132,33,34 et la création d’une molécule Cdr1 déficiente en cystéine35 adaptée aux études de réticulation de cystéine pour vérifier toute future structure à haute résolution. De nombreux autres transporteurs ABC provenant d’agents pathogènes fongiques humains majeurs (c.-à-d. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei et le complexe d’espèces Fusarium solani) ont également été étudiés en détail à l’aide de cette plate-formed’expression24,36,37,38,39. Cela a permis la génération d’un panel de souches de S. cerevisiae surexprimant les pompes d’efflux qui a été utilisé dans les écrans à haut débit pour découvrir le nouveau substrat de pompe d’efflux fluorescent Nile red40 et les inhibiteurs spécifiques de la pomped’efflux41 et à large spectre14,33,42, 43,44. L’utilisation de ce système a également permis la découverte de la clorgyline en tant que premier inhibiteur de pompe d’efflux de médicaments multimédicaments fongiques à large spectre de son genre42.
La solubilisation complète des protéines membranaires et la création d’une préparation homogène de protéines-micelles membranaires dépourvues de lipides endogènes, nécessitent des concentrations détergentes élevées45. Mais malheureusement, cela inactive aussi souvent la protéine membranaire5,8,45,46. Les propriétés des monomères détergents et leur agrégation en solution sont affectées par les propriétés physiques de la queue hydrophobe, la longueur et la ramification de la chaîne alkyle, la présence d’un noyau aromatique ou d’une chaîne latérale fluoroalkyle, ou le nombre d’unités de polyoxyéthylène. Ainsi, le criblage des détergents est une première étape importante pour déterminer le détergent le plus approprié pour la solubilisation et la purification des protéines membranaires.
C. albicans est un pathogène fongique humain majeur des personnes immunodéprimées qui peut causer des infections invasives graves et potentiellement mortelles47, et il peut devenir résistant aux médicaments antifongiques azoles48,49. L’un des principaux mécanismes de la multirésistance aux médicaments de C. albicans est la surexpression de Cdr150, qui est un transporteur de cassette de liaison à l’ATP (ABC) de type II51 de la sous-famille ABCG situé dans la membrane plasmique. Les transporteurs ABCG fongiques pleine grandeur (constitués de deux domaines de liaison aux nucléotides [ND] et de deux domaines transmembranaires [TMD]) sont plus communément appelés transporteurs pléiotropes de résistance aux médicaments (PDR) et se caractérisent par leur topologie unique de domaine inversé [NBD-TMD]2. Les transporteurs PDR ne se trouvent que dans les plantes52,53 et les champignons54. Malgré leur importance, il n’y a pas de structures pour les transporteurs PDR, bien que les structures pour les transporteurs ABCG humains de demi-taille aient récemment été résolues, ce qui a contribué à créer le premier modèle provisoire pour Cdr133. Nos preuves expérimentales récentes suggèrent, cependant, que ce modèle est défectueux peut-être parce que les transporteurs PDR fongiques ont des NBD asymétriques caractéristiques résultant très probablement en un mécanisme de transport unique. Une structure à haute résolution de Cdr1 est donc nécessaire à la fois pour la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs de pompe d’efflux qui peuvent aider à surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, et pour fournir des informations sur le mécanisme d’action de cette importante famille de transporteurs ABC.
L’objectif de cette étude était de développer des protocoles fiables pour l’expression, la solubilisation et la purification de Cdr1 dans l’hôte d’expression de S. cerevisiae génétiquement modifié, dans le but ultime d’obtenir une structure à haute résolution pour Cdr1. Dans le cadre de ce processus, une double étiquette mGFPHis clivée par la protéase(Figure 1B)a été conçue avec un liant à 16 résidus séparant l’étiquette de la terminaison C de Cdr1, ce qui a amélioré la liaison de la balise d’affinité 6x His attachée à la résine d’affinité nickel et a permis de surveiller les niveaux d’expression de Cdr1 dans les cellules vivantes et pendant tout le processus de purification. Un protocole reproductible pour les préparations de protéines de membrane plasmique de levure à petite échelle contenant environ 10% de C. albicans Cdr1 (tel qu’estimé par la coloration de Coomassie après SDS-PAGE) a également été développé, qui pourrait être utilisé pour la caractérisation biochimique de Cdr1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré les progrès récents dans l’analyse structurale des protéines membranaires, aucune structure 3D pour Cdr1, ou tout autre transporteur PDR, n’est actuellement disponible. Il est donc important d’acquérir des connaissances sur la structure Cdr1 et ses caractéristiques biochimiques, car cela donnera non seulement un aperçu de la conception rationnelle de nouveaux médicaments pour surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, mais également du mécanisme de fonctionnement d’une imp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent avec gratitude le financement du New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) et une subvention globale de la Faculté de médecine de l’Université Chulalongkorn, Bangkok, Thaïlande (M. Niimi). Ils souhaitent remercier l’Université d’Otago d’avoir fourni à G. Madani une bourse de doctorat. Les auteurs souhaitent également exprimer leur gratitude au professeur Stefan Raunser et à ses collègues, le Dr Amir Apelbaum et le Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, pour leur soutien et leur supervision lors d’une visite de 6 mois de G. Madani à l’Institut Max Planck de physiologie moléculaire (MPIMP), Dortmund, Allemagne. Les auteurs remercient également le Service allemand d’échanges universitaires (DAAD) d’avoir fourni à G. Madani une subvention de recherche (57381332) pour visiter le MPIMP.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
| 2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG310S | LMNG |
| 2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG322S | DMNG |
| 4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
| 40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
| Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
| Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
| Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
| Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Formedium | DCS0019 | |
| CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
| Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
| Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
| DMSO | Merck | 67-68-5 | |
| Ethanol | Merck | 459836 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | A blend of exonuclease and phosphatase |
| Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
| Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
| Glycine | Merck | G8898 | |
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Use for reliable colony PCR |
| lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
| n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
| n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
| n-Decyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D322S | DM |
| n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside | Anatrace | D310HA | α-DDM |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310S | β-DDM |
| n-Nonyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Nonyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
| n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
| n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
| n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
| n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T315S | TDM |
| n-Tridecyl-phosphocholine | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
| n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T323S | – |
| n-Undecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
| N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
| polyethylene glycol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
| polyoxyethylenesorbitan monooleate | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| Protein Assay Kit | Bio-Rad | 5000122 | RC DC Protein Assay Kit II |
| QC Colloidal Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| Sodium L-ascorbate BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Yeast extract | Formedium | 008013-01-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| Equipment (type) | |||
| Centrifuge (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
| Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) | Bio-Rad | ||
| Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
| Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
| PCR thermal cycler (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
| Power supply (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
| Shaking incubator (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
| UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd | ||
Referências
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