Summary
Her præsenterer vi den cykliske belastningsinducerede intraartikulære brusklæsionsmodel af rotteknæet, genereret af 60 cykliske kompressioner over 20 N, hvilket resulterer i skade på lårbenet kondylarbrusk hos rotter.
Abstract
Patofysiologien af primær slidgigt (OA) forbliver uklar. Imidlertid er en specifik underklassificering af OA i relativt yngre aldersgrupper sandsynligvis korreleret med en historie med ledbruskskader og ledbåndsavulsion. Kirurgiske dyremodeller af OA i knæet spiller en vigtig rolle i forståelsen af begyndelsen og progressionen af posttraumatisk OA og hjælper med udviklingen af nye terapier til denne sygdom. Imidlertid er ikke-kirurgiske modeller for nylig blevet overvejet for at undgå traumatisk betændelse, der kan påvirke evalueringen af interventionen.
I denne undersøgelse blev der udviklet en intraartikulær brusklæsionsrottemodel induceret af in vivo cyklisk trykbelastning, som gjorde det muligt for forskere at (1) bestemme den optimale størrelse, hastighed og varighed af belastning, der kunne forårsage fokal bruskskade; (2) vurdere posttraumatiske spatiotemporale patologiske ændringer i chondrocyt vitalitet; og (3) evaluere den histologiske ekspression af destruktive eller beskyttende molekyler, der er involveret i tilpasnings- og reparationsmekanismerne mod fælles trykbelastninger. Denne rapport beskriver forsøgsprotokollen for denne nye brusklæsion i en rottemodel.
Introduction
Traditionelt er forreste korsbånd (ACL) transsektion eller destabilisering af den mediale menisk blevet betragtet som optimal til undersøgelse af posttraumatisk slidgigt (PTOA) hos små dyr. I de senere år er ikke-invasive cykliske kompressionsmodeller blevet brugt til at studere PTOA. Denne model blev oprindeligt designet til at undersøge det annullerede knoglerespons på mekanisk belastning1 og blev derefter modificeret som en ikke-kirurgisk dyremodel til PTOA-undersøgelser 2,3,4,5,6. Begrundelsen er at kollidere ledbrusk ved at anvende en periodisk ekstern kraft, som udløser en række inflammatoriske reaktioner. Denne model er dog kun blevet anvendt på mus, og den passende størrelse af belastning på større dyr er ikke blevet diskuteret.
Et andet problem med den tidligere model er, at højvolumenprotokollen omfattede for mange cyklusser, hvilket forårsagede overdreven fortykkelse af subkondralbenet, en uønsket bivirkning, i flere prøver7. Derfor blev der udviklet en ny metode til cyklisk kompression med den passende størrelse for store dyr og en lavere belastningsbivirkning8. Det overordnede mål med den nuværende artikel er at beskrive protokollen for den ikke-invasive cykliske kompressionsmodel hos rotter og observere de repræsentative resultater af bruskdegeneration. Den nuværende protokol vil hjælpe læsere, der er interesserede i anvendelsen af den ikke-invasive cykliske kompressionsmodel på rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev godkendt af Animal Research Committee of Kyoto University (godkendelsesnummer: Med kyo 17616).
1. Udfør in vivo cyklisk kompression på rotteknæet
- Inducer eksperimentel dyrebedøvelse
- Inducer anæstesi i en 12 uger gammel Wistar-rotte (256,8 ± 8,7 g) ved indånding af 5% isofluranopløsning i anæstesiboksen.
- Intraperitonealt injicere en blanding af tre bedøvelsesmidler9, herunder medetomidin, midazolam og butorphanol, ved 2 mg / kg af rottens kropsvægt og barbere området omkring højre knæled. Bekræft tilstrækkelig bedøvelse ved manglende pedalrefleks til en tåspids.
- Monter den bedøvede rotte på fikseringsanordningen.
- Placer den bedøvede rotte liggende på maven på bundpladen (figur 1), med højre knæ fastgjort til et lille stykke harpiks med en konkav rille. Placer højre bagben i hofteforlængelsen, knæbøjningen og ankelforlængelsespositionerne, med knæet bøjet ved ca. 140 °. Tilpas rottens hæl på den kileformede rille på den bevægelige armatur.
- Flyt fikseringsanordningen til spændings-/trækprøvningsinstrumentet (se materialetabellen). Når du har sikret dig, at der ikke er kontakt med vejecellen, skal du åbne instrumentstyringssoftwaren til spændings-/trækprøvningsinstrumentet (Materialetabel) og klikke på kalibreringsknappen . Efter kalibrering fastgøres toppen af rammen forsigtigt til vejecellen. For at holde knæleddet tæt fastgjort til rammen skal du langsomt tænde drejeknappen på det bevægelige hovedoperationspanel, indtil forbelastningen når 5 N.
- Byg en indlæsningsmetode, og opsæt tryktesten.
- I hovedmenuen skal du klikke på Opret en ny metode | System etiket. Indstil testtilstand til Cyklus og Testtype til komprimering. Klik på sensoretiketten , og vælg fanen Test for at kontrollere, at grænsen er inden for 60 N. Derudover skal du vælge fanen Streg og kontrollere, at grænsen er inden for 500 mm.
BEMÆRK: Ovenstående trin stopper operationen med det samme, hvis der er en stor forskydning på stresspunktet. - Under kontroletiketten Test skal du vælge Vækstens oprindelse for at starte hovedprogrammet med 0,3 %/fuld skala. Af de fire sektioner i en belastningscyklus skal du indstille slaghastigheden i kontrol i 1. og 3. sektion til 1 mm / s. Indstil den maksimale prøvningskraft i 2. sektion til 20 N og minimumsprøvningskraften i 4. sektion til 5 N. Indstil "varigheden af hold" til 0,5 s for spidsbelastningen og 10 s for minimumsbelastningen (figur 2).
BEMÆRK: Da dette trin definerer hver cyklus, skal du sikre dig, at samlingsfladerne er i kontakt med hinanden og bevæger sig med en rimelig hastighed, og at bevægelsen opretholdes. - Under fanen Forindlæsning nederst på siden skal du sikre dig, at On er markeret, at hastigheden for fjernelse af afbøjning er indstillet til 100 mm/min, og den maksimale kraft er 5 N. I prøveetiketten skal du indstille materialet som metal.
BEMÆRK: Disse detaljerede indstillinger kan være specifikke for hver producent. - I hovedmenuen under afsnittet Vælg metode og test skal du vælge den metode, der lige blev bygget, og klikke på Start for at starte testen.
BEMÆRK: Tabellen nederst viser de faktiske målinger af spidsbelastning og forskydning. - Indstil antallet af cyklusser til 60.
BEMÆRK: Hele indlæsningssessionen inkluderer 60 cyklusser, som varer ca. 12 min. I kontrolgruppen gennemgik rotter 5 N forbelastning i 12 minutters forbelastning under de samme forhold.
- I hovedmenuen skal du klikke på Opret en ny metode | System etiket. Indstil testtilstand til Cyklus og Testtype til komprimering. Klik på sensoretiketten , og vælg fanen Test for at kontrollere, at grænsen er inden for 60 N. Derudover skal du vælge fanen Streg og kontrollere, at grænsen er inden for 500 mm.
- Efter lastning skal du returnere rotten til sit bur og overvåge indtil fuld genopretning. Oprethold en 12-12 timers lys-mørk tidsplan i buret med tilstrækkelig plads og mad ad libitum. Efter de krævede forsøgsperioder ofres rotterne med en overdosis af blandingen af de tre bedøvelsesmidler injiceret intraperitonealt eller kuldioxidindånding til analyse (1 h-8 uger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der blev opnået et repræsentativt resultat af de kortsigtede ændringer (1 time og 12 timer) i chondrocytlevedygtigheden i prøver, der blev udsat for 20 N cyklisk belastning. Som vist i figur 3 steg antallet af døde kondrocytter (rød fluorescens) ved 12 timer efter traumet. Omvendt fortsatte antallet af levende chondrocytter (grøn fluorescens) med at falde, idet nogle prøver ikke indeholdt levende chondrocytter i det berørte område.
Histologi viste, at ledbrusken i rotteknæene, der gennemgik 20 N dynamisk belastning, var beskadiget, og en fokal læsionszone blev bekræftet i den laterale lårbenskondyle i alle prøverne (figur 4). Imidlertid steg læsionsstørrelsen ikke gradvist i løbet af den 8-ugers observationsperiode. Grænsen, der svarede til grænsefladen mellem læsionen og den upåvirkede brusk, kunne observeres i det berørte område.
Figur 1: Fikseringsanordningen består af en bundplade og et fikseringsapparat. Bundpladen (længde: 27,5 cm, bredde: 13 cm) har en harpiks konkav rille (længde: 0,8 cm, bredde: 0,4 cm) på den bageste side for at rumme rottens bøjede knæled. Fikseringsapparatet har en kileformet rille (rillebredde: 1,5 cm, rilledybde: 1 cm), der rummer rottens hæl, som er indlejret i bundpladen mellem to metalstænger. Toppen af fikseringsapparatet vil være i direkte kontakt med belastningscellen på stress-/træktestinstrumentet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Belastningsprofil for en indlæsningscyklus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Spatiotemporal vurdering af chondrocytlevedygtighed i læsionsområdet. Efter ofring blev knæleddet dissekeret og adskilt ved hjælp af små tang og saks. Opløsninger af calcein AM- og EthD-1-pletter blev fremstillet ved fortynding af det originale sæt (materialetabel) henholdsvis kl. 1:500 og 1:4.000 i 5 ml PBS. Prøverne blev inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Kontrolprøver blev nedsænket i PBS under de samme betingelser. Fluorescensbilleder blev opnået ved hjælp af et fluorescensmikroskop (materialetabel) ved anvendelse af fluoresceinisothiocyanat (495 nm / 519 nm) og propidiumiodid (535 nm / 617 nm) kanaler. De vitale kondrocytter viste grøn fluorescens, mens døde celler fluorescerede rødt. Sammenlignet med chondrocytterne i kontrolprøver (A) blev antallet af døde chondrocytter på det belastede rotteknæ øget ved 1 time (B) og optog det meste af området i det berørte område ved 12 timer (C). Grøn og rød fluorescens repræsenterer regionerne i henholdsvis de levende og døde kondrocytter. Skala søjler = 100 μm. Forkortelser: calcein AM = calcein acetoxymethylester; EthD-1 = ethidium homodimer-1; PBS= fosfatbufferet saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ safranin O farvning af lårbenet i det fyldte knæ. Et dias, der viser de sagittale sektioner af den laterale lårbenskondyle, som var farvet med en safranin O / Fast Green og hæmatoxylinopløsning. Sammenlignet med kontrollen blev safranin O-farvningsintensiteten i det berørte område reduceret efter påfyldning, og der blev observeret en klar kant (pil) af den øvre / forkalkede brusk. Skala søjler = 100 μm. Forkortelse: w = uge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For første gang viser den nuværende protokol, hvordan man etablerer en model for belastningsinduceret brusklæsion på den laterale lårbenskondyle hos rotter, svarende til den intraartikulære skademodel hos mindre gnavere som musen2. Imidlertid forårsagede belastningsprotokollen hos mus alvorlig osteofytdannelse og korsbåndslæsioner, hvilket ikke var ideelt til evaluering af virkningerne af cyklisk kompression. Den nuværende protokol skabte en fokal brusklæsion hos rotter med en meget lavere belastningskraft. Korrekte indstillinger for indlæsningsmetode er kritiske for protokollen, fordi kun den passende størrelse, hastighed og varighed af stress kan ødelægge brusk uden at beskadige knoglevævet.
Indstilling af forskydningsgrænsen (protokoltrin 1.3.1) er også afgørende, da det straks stopper instrumentet i tilfælde af ledbåndsbrud, eller hvis rotten vågner op fra anæstesi under belastningssessionen. Den optimale maksimale belastning og rottens alder er endnu ikke fastlagt. I de indledende forsøg resulterede en belastning på over 50 N imidlertid i en høj sandsynlighed for ACL-brud i rottens knæ. Desuden er den nuværende model vanskelig at reproducere hos ældre (>36 uger gamle) rotter, muligvis på grund af bruskens stivhed, når væksten opstår.
Selvom den destruktive belastningstærskel for yngre rotter ikke blev bestemt, menes det, at fremtidige undersøgelser bør holde den maksimale belastning under 20 N for at observere eventuelle anabolske virkninger på brusk. Omfanget og lokaliseringen af læsionsområdet var relativt ligetil at etablere, selv for dem, der var nye på området, som estimeret af det kondrocytdegenerative volumen i hver prøve, som potentielt fokuserede på den efterfølgende evaluering af interventionen til et relativt smalt bruskområde.
Histologisk farvning viste, at læsionsområdets omfang var relativt stabilt i den 8-ugers observationsperiode. Mankins score forværredes imidlertid kontinuerligt, mens matrixfarvnings- og cellefordelingsscorerne steg i det berørte område. Desuden var der en tydelig farveafvigelse mellem mellemlaget og den forkalkede brusk, hvilket illustrerede, at kun brusk over tidevandsmærket blev påvirket af den interartikulære kompression.
Tværtimod, bortset fra mild fibrillering i sjældne prøver, forblev bruskens integritet stort set intakt i hele observationsperioden, hvilket adskiller sig fra progressive OA-skademodeller10. Derfor kan en ikke-kirurgisk model være bedre til vurdering af bruskgrænsefladekollisionsinducerede fokale læsioner, som er mere almindelige ved sportsskader. I fremtiden vil den nuværende model blive brugt til at vurdere virkningerne af medicin eller fysioterapi, såsom hypertermibehandling og aerob ledtræning, på traumatisk bruskskade. Desuden kunne chondrocytanabolisme og katabolisme som reaktion på cyklisk mekanisk stimulering også valideres in vivo hos dyr ved hjælp af denne model.
Den nuværende protokol havde flere begrænsninger. For det første blev kun brusklæsioner på den laterale lårbenskondyle undersøgt. Læsionen på lateral skinnebenet bør også evalueres i fremtidige undersøgelser. For det andet var den læsionerede del af ledbrusk, der blev undersøgt i den nuværende protokol, ikke den vigtigste belastningsbærende region under gang. På grund af bruskens heterogenitet kan stivheden af intraartikulær brusk afvige fra den del, der undersøges i den aktuelle undersøgelse. Disse resultater kan således kun bruges som reference. Endelig viste modellen ingen signifikant progression af bruskdegeneration, hvilket er et vigtigt træk ved OA-udviklingen. Yderligere undersøgelser kunne kombinere invasiv kirurgi med forudindlæste læsioner for at observere spatiotemporale ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af et JSPS KAKENHI-tilskud (numrene JP18H03129 og JP18K19739).
Denne forskning modtog også finansiering fra Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), som støttes af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) og National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) fra National Institutes of Health under tildelingsnummer P2CHD086843. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
- De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
- Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
- Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
- Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
- Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
- Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
- Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
- Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).
