Summary
Qui, presentiamo il modello di lesione cartilaginea intra-articolare indotta dal carico ciclico del ginocchio di ratto, generato da 60 compressioni cicliche su 20 N, con conseguente danno alla cartilagine condilare femorale nei ratti.
Abstract
La fisiopatologia dell'osteoartrite primaria (OA) rimane poco chiara. Tuttavia, una sottoclassificazione specifica di OA in gruppi di età relativamente più giovani è probabilmente correlata con una storia di danno alla cartilagine articolare e avulsione legamentosa. I modelli animali chirurgici di OA del ginocchio svolgono un ruolo importante nella comprensione dell'insorgenza e della progressione dell'OA post-traumatica e aiutano nello sviluppo di nuove terapie per questa malattia. Tuttavia, i modelli non chirurgici sono stati recentemente considerati per evitare infiammazioni traumatiche che potrebbero influenzare la valutazione dell'intervento.
In questo studio, è stato sviluppato un modello di ratto con lesione cartilaginea intra-articolare indotto da carico ciclico di compressione in vivo , che ha permesso ai ricercatori di (1) determinare l'entità, la velocità e la durata ottimali del carico che potrebbero causare danni alla cartilagine focale; (2) valutare i cambiamenti patologici spaziotemporali post-traumatici nella vitalità dei condrociti; e (3) valutare l'espressione istologica di molecole distruttive o protettive coinvolte nei meccanismi di adattamento e riparazione contro i carichi di compressione articolari. Questo rapporto descrive il protocollo sperimentale per questa nuova lesione cartilaginea in un modello di ratto.
Introduction
Tradizionalmente, la transezione del legamento crociato anteriore (LCA) o la destabilizzazione del menisco mediale è stata considerata ottimale per lo studio dell'osteoartrite post-traumatica (PTOA) nei piccoli animali. Negli ultimi anni, modelli di compressione ciclica non invasivi sono stati utilizzati per studiare la PTOA. Questo modello è stato originariamente progettato per studiare la risposta ossea spugnosa al carico meccanico1 ed è stato poi modificato come modello animale non chirurgico per gli studi PTOA 2,3,4,5,6. Il razionale è quello di far collidere la cartilagine articolare applicando una forza esterna periodica, che innesca una serie di risposte infiammatorie. Tuttavia, questo modello è stato applicato solo ai topi e l'entità appropriata del carico su animali più grandi non è stata discussa.
Un altro problema con il modello precedente è che il protocollo ad alto volume includeva troppi cicli, che causavano un eccessivo ispessimento dell'osso subcondrale, un effetto collaterale indesiderato, in diversi campioni7. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo metodo di compressione ciclica con la grandezza appropriata per animali di grossa taglia e un effetto collaterale di carico inferiore8. L'obiettivo generale del presente articolo è quello di descrivere il protocollo del modello di compressione ciclica non invasivo nei ratti e osservare i risultati rappresentativi della degenerazione della cartilagine. L'attuale protocollo aiuterebbe i lettori interessati all'applicazione del modello di compressione ciclica non invasivo sui ratti.
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Protocol
Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la ricerca sugli animali dell'Università di Kyoto (numero di approvazione: Med kyo 17616).
1. Eseguire la compressione ciclica in vivo sul ginocchio del ratto
- Indurre l'anestesia animale sperimentale
- Indurre l'anestesia in un ratto Wistar di 12 settimane (256,8 ± 8,7 g) mediante inalazione di soluzione di isoflurano al 5% nella scatola dell'anestesia.
- Iniettare per via intraperitoneale una miscela di tre agenti anestetici9, tra cui medetomidina, midazolam e butorfanolo, a 2 mg/kg del peso corporeo del ratto e radere l'area intorno all'articolazione destra del ginocchio. Confermare l'anestesia sufficiente per mancanza di riflesso del pedale a un pizzico di punta.
- Montare il ratto anestetizzato sul dispositivo di fissaggio.
- Posizionare il ratto anestetizzato sdraiato sulla pancia sulla piastra di base (Figura 1), con il ginocchio destro attaccato a un piccolo pezzo di resina con una scanalatura concava. Posizionare l'arto posteriore destro nelle posizioni di estensione dell'anca, flessione del ginocchio e estensione della caviglia, con il ginocchio flesso a circa 140°. Accomodare il tallone del topo sulla scanalatura a forma di cuneo sul dispositivo mobile.
- Spostare il dispositivo di fissaggio sullo strumento di prova di sollecitazione/trazione (vedere la tabella dei materiali). Dopo essersi assicurati che non vi siano contatti con la cella di carico, aprire il software di controllo dello strumento di prova di sollecitazione/trazione (Table of Materials) e fare clic sul pulsante Calibration . Dopo la calibrazione, fissare con attenzione la parte superiore del telaio alla cella di carico. Per mantenere l'articolazione del ginocchio strettamente attaccata al telaio, accendere lentamente la manopola rotante sul pannello operativo principale mobile fino a quando il precarico raggiunge 5 N.
- Creare un metodo di caricamento e impostare il test di compressione.
- Nel menu principale, fare clic su Crea un nuovo metodo | Etichetta di sistema . Impostare Modalità test su Ciclo e Tipo test su Compressione. Fare clic sull'etichetta Sensore e selezionare la scheda Test per verificare che il limite sia entro 60 N. Inoltre, selezionate la scheda Traccia e verificate che il limite sia compreso tra 500 mm.
NOTA: il passaggio precedente interromperà immediatamente l'operazione se si verifica un grande spostamento sul punto di sollecitazione. - Sotto l'etichetta di controllo Test, selezionare Origine della crescita per avviare il programma principale con 0,3%/fondo scala. Delle quattro sezioni in un ciclo di carico, impostare la velocità di corsa in controllo nella 1ae 3asezione su 1 mm/s. Impostare la forza di prova massima nella 2a sezione su 20 N e la forza di prova minima nella 4asezione su 5 N. Impostare "la durata della sospensione" su 0,5 s per il carico di picco e 10 s per il carico minimo (Figura 2).
NOTA: poiché questo passaggio definisce ogni ciclo, assicurarsi che le superfici articolari siano in contatto tra loro e si muovano a una velocità ragionevole e che il movimento venga mantenuto. - Nella scheda Precaricamento nella parte inferiore della pagina, assicurarsi che On sia selezionato, che la velocità di rimozione della deflessione sia impostata su 100 mm/min e che la forza massima sia 5 N. Nell'etichetta Campione , impostare il materiale come metallo.
NOTA: queste impostazioni dettagliate possono essere specifiche per ogni produttore. - Nel menu Principale, nella sezione Seleziona metodo e test, selezionare il metodo appena creato e fare clic su Avvia per iniziare il test.
NOTA: La tabella in basso mostra le misurazioni effettive del carico di picco e dello spostamento. - Impostare il numero di cicli su 60.
NOTA: L'intera sessione di caricamento comprende 60 cicli, che dura circa 12 minuti. Nel gruppo di controllo, i ratti sono stati sottoposti a 5 N di pre-carico per 12 minuti di pre-carico nelle stesse condizioni.
- Nel menu principale, fare clic su Crea un nuovo metodo | Etichetta di sistema . Impostare Modalità test su Ciclo e Tipo test su Compressione. Fare clic sull'etichetta Sensore e selezionare la scheda Test per verificare che il limite sia entro 60 N. Inoltre, selezionate la scheda Traccia e verificate che il limite sia compreso tra 500 mm.
- Dopo il caricamento, riportare il ratto nella sua gabbia e monitorare fino al completo recupero. Mantenere un programma chiaro-buio di 12-12 ore nella gabbia con spazio sufficiente e cibo ad libitum. Dopo i periodi sperimentali richiesti, sacrificare i ratti con un sovradosaggio della miscela dei tre agenti anestetici iniettati per via intraperitoneale o inalazione di anidride carbonica per l'analisi (1 h-8 settimane).
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Representative Results
È stato ottenuto un risultato rappresentativo delle variazioni a breve termine (1 ora e 12 ore) della vitalità dei condrociti in campioni sottoposti a carico ciclico di 20 N. Come mostrato nella Figura 3, il numero di condrociti morti (fluorescenza rossa) è aumentato a 12 ore dopo il trauma. Al contrario, il numero di condrociti viventi (fluorescenza verde) ha continuato a diminuire, con alcuni campioni che non contengono condrociti vivi nell'area interessata.
L'istologia ha mostrato che la cartilagine articolare delle ginocchia di ratto sottoposte a carico dinamico di 20 N era danneggiata e una zona focale della lesione è stata confermata nel condilo femorale laterale in tutti i campioni (Figura 4). Tuttavia, la dimensione della lesione non è aumentata progressivamente durante il periodo di osservazione di 8 settimane. Il bordo che corrispondeva all'interfaccia della lesione e della cartilagine non interessata poteva essere osservato nella zona interessata.
Figura 1: Il dispositivo di fissazione è costituito da una piastra di base e da un apparecchio di fissaggio. La piastra di base (lunghezza: 27,5 cm, larghezza: 13 cm) ha una scanalatura concava in resina (lunghezza: 0,8 cm, larghezza: 0,4 cm) sul lato posteriore per ospitare l'articolazione flessa del ginocchio del ratto. L'apparato di fissaggio ha una scanalatura a forma di cuneo (larghezza della scanalatura: 1,5 cm, profondità della scanalatura: 1 cm) che ospita il tallone del topo, che è annidato nella piastra di base tra due barre metalliche. La parte superiore dell'apparecchio di fissaggio sarà a diretto contatto con la cella di carico dello strumento di prova di sollecitazione/trazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Profilo di carico per un ciclo di caricamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valutazione spaziotemporale della vitalità dei condrociti nell'area della lesione. Dopo il sacrificio, l'articolazione del ginocchio è stata sezionata e separata usando piccole pinze e forbici. Le soluzioni di coloranti calceina AM ed EthD-1 sono state preparate diluendo il kit originale (Table of Materials) rispettivamente a 1:500 e 1:4.000 in 5 ml di PBS. I campioni sono stati incubati per 20 minuti a temperatura ambiente. I campioni di controllo sono stati immersi in PBS nelle stesse condizioni. Le immagini di fluorescenza sono state ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza (Table of Materials) utilizzando canali isotiocianato di fluoresceina (495 nm/519 nm) e ioduro di propidio (535 nm/617 nm). I condrociti vitali mostravano fluorescenza verde, mentre le cellule morte erano fluorescenti rosse. Rispetto ai condrociti nei campioni di controllo (A), il numero di condrociti morti sul ginocchio di ratto caricato è aumentato a 1 ora (B) e ha occupato la maggior parte dell'area nella regione interessata a 12 ore (C). La fluorescenza verde e rossa rappresentano rispettivamente le regioni dei condrociti vivi e morti. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: calceina AM = calceina acetoxymethyl ester; EthD-1 = omodimero di etidio-1; PBS= soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Safranina rappresentativa O colorazione del condilo femorale nel ginocchio caricato. Una diapositiva che mostra le sezioni sagittali del condilo femorale laterale, che sono state colorate con una soluzione di safranina O / Fast Green ed ematossilina. Rispetto al controllo, l'intensità della colorazione della safranina O nell'area interessata è diminuita dopo il carico ed è stato osservato un bordo chiaro (freccia) della cartilagine superiore / calcificata. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazione: w = settimana. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Per la prima volta, l'attuale protocollo mostra come stabilire un modello di lesione cartilaginea indotta dal carico sul condilo femorale laterale nei ratti, simile al modello di danno intra-articolare nei roditori più piccoli come il topo2. Tuttavia, il protocollo di carico nei topi ha causato gravi formazioni osteofite e lesioni del legamento crociato, che non era l'ideale per valutare gli effetti della compressione ciclica. L'attuale protocollo ha creato una lesione focale della cartilagine nei ratti con una forza di carico molto più bassa. Le corrette impostazioni del metodo di caricamento sono fondamentali per il protocollo perché solo l'entità, la velocità e la durata appropriate dello stress possono distruggere la cartilagine senza danneggiare il tessuto osseo.
Anche l'impostazione del limite di spostamento (fase del protocollo 1.3.1) è fondamentale in quanto arresta immediatamente lo strumento in caso di rottura del legamento o se il ratto si sveglia dall'anestesia durante la sessione di carico. Il carico massimo ottimale e l'età del ratto rimangono da determinare. Tuttavia, negli esperimenti preliminari, un carico di oltre 50 N ha comportato un'alta probabilità di rottura del LCA nelle ginocchia del ratto. Inoltre, il modello attuale è difficile da riprodurre nei ratti più anziani (>36 settimane), probabilmente a causa della rigidità della cartilagine durante la crescita.
Sebbene la soglia di carico distruttivo per i ratti più giovani non sia stata determinata, si ritiene che studi futuri dovrebbero mantenere il carico massimo sotto 20 N per osservare eventuali effetti anabolici sulla cartilagine. L'ambito e la localizzazione dell'area della lesione erano relativamente semplici da stabilire, anche per chi era nuovo al campo, come stimato dal volume degenerativo dei condrociti in ciascun campione, che potenzialmente si concentrava sulla successiva valutazione dell'intervento su un'area cartilaginea relativamente stretta.
La colorazione istologica ha dimostrato che l'ambito dell'area della lesione era relativamente stabile durante il periodo di osservazione di 8 settimane. Tuttavia, i punteggi di Mankin si deterioravano continuamente mentre i punteggi di colorazione della matrice e di distribuzione cellulare aumentavano nell'area interessata. Inoltre, c'era un'evidente deviazione di colore tra lo strato intermedio e la cartilagine calcificata, che illustrava che solo la cartilagine sopra la marea era influenzata dalla compressione interarticolare.
Al contrario, a parte una lieve fibrillazione in campioni rari, l'integrità della cartilagine è rimasta in gran parte intatta durante l'intero periodo di osservazione, che è diverso dai modelli di lesione progressiva OA10. Pertanto, un modello non chirurgico può essere migliore per la valutazione delle lesioni focali indotte dalla collisione dell'interfaccia cartilaginea, che sono più comuni nelle lesioni sportive. In futuro, il modello attuale sarà utilizzato per valutare gli effetti di farmaci o terapia fisica, come la terapia di ipertermia e l'esercizio articolare aerobico, sul danno traumatico della cartilagine. Inoltre, l'anabolismo e il catabolismo dei condrociti in risposta alla stimolazione meccanica ciclica potrebbero anche essere convalidati in vivo negli animali utilizzando questo modello.
Il protocollo attuale aveva diverse limitazioni. In primo luogo, sono state studiate solo le lesioni della cartilagine sul condilo femorale laterale. Anche la lesione sulla tibia laterale deve essere valutata in studi futuri. In secondo luogo, la parte lesionata della cartilagine articolare studiata nel protocollo attuale non era la principale regione portante durante la deambulazione. A causa dell'eterogeneità della cartilagine, la rigidità della cartilagine intra-articolare può differire dalla parte esaminata nel presente studio. Pertanto, questi risultati possono essere utilizzati solo come riferimento. Infine, il modello non ha mostrato alcuna progressione significativa della degenerazione della cartilagine, che è una caratteristica importante dello sviluppo dell'OA. Ulteriori studi potrebbero combinare la chirurgia invasiva con lesioni precaricate per osservare i cambiamenti spaziotemporali.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione JSPS KAKENHI (numeri JP18H03129 e JP18K19739).
Questa ricerca ha anche ricevuto finanziamenti dall'Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), che è supportata dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health con il numero di premio P2CHD086843. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
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