בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .
Abstract
Caenorhabditis elegans היה מערכת מודל חשוב למחקר ביולוגי מאז הוצג בשנת 1963. עם זאת, C. elegans לא נוצל באופן מלא במחקר הביוכימי של תגובות ביולוגיות באמצעות תמציות גרעיניות שלה כגון תמלול במבחנה ושכפול DNA. משוכה משמעותית לשימוש C. elegans במחקרים ביוכימיים היא לשבש את החתך החיצוני העבה של הנמטודה מבלי להקריב את הפעילות של התמצית הגרעינית. בעוד מספר שיטות משמשות כדי לשבור את הקיטור, כגון הומוגניזציה Dounce או sonication, הם לעתים קרובות להוביל חוסר יציבות חלבון. אין פרוטוקולים מבוססים לבידוד חלבונים גרעיניים פעילים מזחלים או C. elegans למבוגרים לתגובות במבחנה . כאן, הפרוטוקול מתאר בפירוט את ההומוגניזציה של שלב זחל 4 C. elegans באמצעות הומוגניזר Balch. ההומוגניזר הבלץ’ משתמש בלחץ כדי לאלץ את בעלי החיים באיטיות לעבור פער צר ששובר את הקיטור בתהליך. העיצוב האחיד והעיצוב המדויק של ההומוגניזר בלך מאפשרים שחיקה עקבית של בעלי חיים בין ניסויים. פירוק ההומוגנית המתקבלת מההומוגניזר Balch מניבה תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית שניתן להשתמש בה בשיטת מבחנה לבדיקת פעילות שעתוק של C. elegans.
Introduction
הנמטודה הקטנה, החיה החופשית Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל פשוט אך רב עוצמה לטיפול במגוון רחב של שאלות ביולוגיות. מאז הצגתו בשנת 1963, הנמטודות היו יקרות ערך לענות על שאלות נוירוביולוגיה, חילוף החומרים, הזדקנות, התפתחות, חסינות, וגנטיקה1. חלק מהמאפיינים הרבים של החיה שהופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי כוללים זמן דור קצר, האפקטיביות של הפרעות RNA, גוף שקוף, ואת המפות הושלמו של שושלת התאים שלה ומערכת העצבים.
בעוד שתרומת הנמטודה למדע היא עצומה, הם נוצלו פחות כדי להדגיש את מערכת התמלול האוקריוטית, כאשר רוב הבנתנו לגבי מנגנונים אלה מגיעה ממחקרים המשתמשים בתמצית גרעינית של שמרים, זבובי פירות ותרבות תאי יונקים2. המשוכה הגדולה ביותר שמניאת את החוקרים מחילוצת תמצית גרעינית תפקודית היא הגוון החיצוני הקשוח של הנמטודה. שלד חיצוני זה כולל קולגנים מקושרים, חותך, גליקופרוטאין ושומנים, מה שהופך את C. elegans משלב הזחל לבגרות עמידים להפקת חלבונים באמצעות כוחות כימיים או מכניים3. מערכת תמלול במבחנה באמצעות תמצית גרעינית C. elegans פותחה בעבר אך לא אומצה באופן נרחב בשל ההיקף המוגבל של המערכת, והשימוש בהומוגניזר Dounce להכנת התמצית עלול להוביל לחוסר יציבות בחלבון4,5.
שלא כמו הפרוטוקול הקודם לבידוד תמצית גרעינית אשר השתמש homogenizer Dounce לשבור C. elegans, פרוטוקול זה משתמש homogenizer Balch. ההומוגניזר Balch מורכב משני מרכיבים עיקריים: כדור קרביד טונגסטן ובלוק נירוסטה עם ערוץ משועמם דרך מקצה לקצה. ההומוג’ייזר Balch טעון עם כדור קרביד טונגסטן וכתרים משני הצדדים כדי לאטום את תא הטחינה. מזרקים ניתן לטעון על שתי היציאות האנכיות המובילות לתא הטחינה. כאשר החומר מועבר ממזרק אחד לשני דרך תא הטחינה, הלחץ מהמזרקים מאלץ את החומר דרך רווח צר בין הכדור לקיר התא. לחץ איטי וקבוע זה שובר את החומר עד שהוא מגיע לגודל עקבי המסוגל לעבור דרך הפער הצר בקלות. אילוץ C. elegans דרך הפער הצר באמצעות לחץ מתמיד אך עדין שובר את בעלי החיים פתוח, שחרור התוכן שלהם לתוך חוצץ שמסביב. החלפת גדלי הכדור מהדקת עוד יותר את הפער, שוברת את התאים החדשים ששוחררו ומשחררת את הגרעינים לתוך המאגר. מקרים מרובים של צנטריפוגה מפרידים את הגרעינים משאר פסולת התא, ומאפשרים איסוף של תמצית גרעינית נקייה. הומוגניזר Balch מועדף על פני homogenizer Dounce מכמה סיבות: המערכת יכולה להתמודד עם מספר רב של בעלי חיים, מה שמאפשר לחלץ כמות גבוהה של חלבונים פעילים בניסיון אחד; עיבוד מדויק של הכדורים ואת בלוק הפלדה מאפשר שחיקה עקבית בין דגימות מרובות; בלוק הפלדה הכבדה משמש ככיור חום, מושך חום באופן אחיד מתא הטחינה, ומונע דנטורינג.
לאחר הבידוד, יש לאמת את פעילות התמלול של התמלול של התמליל של התמצית הגרעינית לפני השימוש בניסויים ביוכימיים כלשהם. באופן מסורתי, פעילות שעתוק נמדדה באמצעות נוקלאוטידים עם תווית רדיו כדי לעקוב ולדמיין את הרנ”א המסונתז החדש. עם זאת, תיוג רדיואקטיבי יכול להיות מעיק כפי שהוא דורש זהירות במהלך השימוש וסילוק6. ההתקדמות הטכנולוגית מאפשרת לחוקרים כיום להשתמש בשיטות הרבה פחות מזיקות או בעייתיות כדי למדוד אפילו כמויות RNA קטנות באמצעות טכניקות כגון PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)7. כאן, הפרוטוקול מתאר שיטה לבודד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 (L4) C. elegans ולדמיין פעילות שעתוק במערכת במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans הוא אורגניזם מודל מושך ללמוד את מערכת התמלול האוקריוטית בגלל התחזוקה הזולה שלה ואת הקלות של מניפולציה גנטית. כאן פרוטוקול לבידוד עקבי של תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית מ L4 C. elegans מתואר. למרות שפרוטוקול זה התמקד בהדמיית פעילות התמלול, ניתן לכמת את ה- cDNA שהופק לאחר שעתוק ב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH MIRA (R35GM124678 ל- J. S. ).
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
