Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Summary

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l’estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l’attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans è stato un importante sistema modello per la ricerca biologica da quando è stato introdotto nel 1963. Tuttavia, C. elegans non è stato pienamente utilizzato nello studio biochimico delle reazioni biologiche utilizzando i suoi estratti nucleari come la trascrizione in vitro e la replicazione del DNA. Un ostacolo significativo per l’uso di C. elegans negli studi biochimici è interrompere la spessa cuticola esterna del nematode senza sacrificare l’attività dell’estratto nucleare. Mentre diversi metodi sono usati per rompere la cuticola, come l’omogeneizzazione di Dounce o la sonicazione, spesso portano all’instabilità delle proteine. Non esistono protocolli stabiliti per isolare proteine nucleari attive da larve o C. elegans adulti per reazioni in vitro . Qui, il protocollo descrive in dettaglio l’omogeneizzazione dello stadio larvale 4 C. elegans utilizzando un omogeneizzatore Balch. L’omogeneizzatore Balch utilizza la pressione per forzare lentamente gli animali attraverso uno stretto spazio che rompe la cuticola nel processo. Il design uniforme e la lavorazione precisa dell’omogeneizzatore Balch consentono una rettifica costante degli animali tra gli esperimenti. Il frazionamento dell’omogeneizzatore ottenuto dall’omogeneizzatore di Balch produce un estratto nucleare funzionalmente attivo che può essere utilizzato in un metodo in vitro per l’analisi dell’attività di trascrizione di C. elegans.

Introduction

Il piccolo nematode caenorhabditis elegans è un organismo modello semplice ma potente per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche. Fin dalla sua introduzione nel 1963, i nematodi sono stati preziosi per rispondere a domande di neurobiologia, metabolismo, invecchiamento, sviluppo, immunità e ^genetica1. Alcune delle molte caratteristiche dell’animale che lo rendono un organismo modello ideale includono il breve tempo di generazione, l’efficacia dell’interferenza dell’RNA, il corpo trasparente e le mappe completate sia del suo lignaggio cellulare che del sistema nervoso.

Mentre i contributi del nematode alla scienza sono vasti, sono stati sottoutilizzati per chiarire il sistema di trascrizione eucariotica, con la maggior parte della nostra comprensione di questi meccanismi proveniente da studi che utilizzano estratto nucleare da lievito, moscerino della frutta e coltura cellulare di ^mammiferi2. Il più grande ostacolo che dissuade i ricercatori dall’estrarre l’estratto nucleare funzionale è la cuticola esterna dura del nematode. Questo esoscheletro comprende collageni reticolati, cuticlini, glicoproteine e lipidi, rendendo C. elegans dallo stadio larvale all’età adulta resistente all’estrazione di proteine attraverso forze chimiche o ^meccaniche3. Un sistema di trascrizione in vitro che utilizza l’estratto nucleare di C. elegans è stato sviluppato una volta, ma non ampiamente adottato a causa della portata limitata del sistema, e l’uso dell’omogeneizzatore Dounce per preparare l’estratto potrebbe portare all’instabilità proteica4,5.

A differenza del precedente protocollo per l’isolamento dell’estratto nucleare che utilizzava un omogeneizzatore Dounce per rompere C. elegans, questo protocollo utilizza un omogeneizzatore Balch. L’omogeneizzatore Balch è costituito da due componenti principali: una sfera in carburo di tungsteno e un blocco in acciaio inossidabile con un canale forato da un’estremità all’altra. L’omogeneizzatore Balch viene caricato con la sfera in carburo di tungsteno e tappato su entrambi i lati per sigillare la camera di macinazione. Le siringhe possono essere caricate sulle due porte verticali che conducono nella camera di rettifica. Quando il materiale viene fatto passare da una siringa all’altra attraverso la camera di macinazione, la pressione delle siringhe forza il materiale attraverso uno stretto spazio tra la sfera e la parete della camera. Questa pressione lenta e costante rompe il materiale fino a raggiungere una dimensione costante che è in grado di passare facilmente attraverso lo stretto spazio. Forzare C. elegans attraverso lo stretto spazio attraverso una pressione costante ma delicata rompe gli animali aperti, rilasciando il loro contenuto nel buffer circostante. La commutazione delle dimensioni della sfera stringe ulteriormente lo spazio, rompendo le cellule appena rilasciate e liberando i nuclei nel buffer. Più istanze di centrifugazione separano i nuclei dal resto dei detriti cellulari, consentendo la raccolta di un estratto nucleare pulito. L’omogeneizzatore Balch è preferito all’omogeneizzatore Dounce per diversi motivi: il sistema può gestire un gran numero di animali, rendendo possibile l’estrazione di un’elevata quantità di proteine attive in un solo tentativo; la lavorazione precisa delle sfere e del blocco di acciaio consente una rettifica costante tra più campioni; il pesante blocco di acciaio funge da dissipatore di calore, allontanando uniformemente il calore dalla camera di macinazione, prevenendo la denaturazione.

Dopo l’isolamento, l’attività trascrizionale dell’estratto nucleare deve essere verificata prima di essere utilizzata in qualsiasi esperimento biochimico. Tradizionalmente, l’attività di trascrizione è stata misurata utilizzando nucleotidi radiomarcati per tracciare e visualizzare l’RNA appena sintetizzato. Tuttavia, l’etichettatura radioattiva può essere onerosa in quanto richiede precauzioni durante l’uso e lo ^smaltimento6. I progressi tecnologici consentono oggi ai ricercatori di utilizzare metodi molto meno dannosi o fastidiosi per misurare anche piccole quantità di RNA utilizzando tecniche come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)⁷. Qui, il protocollo descrive un metodo per isolare l’estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 (L4) C. elegans e visualizzare l’attività di trascrizione in un sistema in vitro.

Protocol

1. Preparazioni dei media Preparare piastre di agar sterili in brodo di lisogenesi (LB) e fluidi liquidi seguendo le istruzioni del produttore. Striscia Escherichia coli (E. coli) ceppo OP50 su una piastra di agar LB. Incubare la striscia batterica a 37 °C durante la notte. Conservare la piastra striata di E. coli OP50 a 4 °C dopo l’incubazione. La piastra E. coli OP50 può essere conservata in modo sicuro a 4 °C per 2 settimane se avvolta in parafilm p…

Representative Results

Seguendo i passaggi delineati dovrebbe produrre estratto nucleare funzionale (Figura 1), la deviazione nelle fasi di macinazione o lavaggio può portare a scarsa attività o bassi rendimenti. Se si ottiene un estratto nucleare funzionale di C. elegans , trascriverà la regione a valle del promotore CMV sul modello di DNA quando aggiunto al test in vitro precedentemente descritto. Il trascritto di RNA risultante può essere purificato dalle …

Discussion

C. elegans è un organismo modello attraente per studiare il sistema di trascrizione eucariotica a causa del suo basso costo di manutenzione e della facilità di manipolazione genetica. Qui viene descritto un protocollo per l’isolamento coerente dell’estratto nucleare funzionalmente attivo da L4 C. elegans . Sebbene questo protocollo si concentrasse sulla visualizzazione dell’attività di trascrizione, il cDNA prodotto post-trascrizionalmente può essere quantificato utilizzando RT-qPCR per ottenere una…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010