בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה
Summary
עבודה זו מתעדת שיטה פשוטה ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה. הטכניקה ניתנת להתאמה למגוון אנטיגנים במגוון רחב של ריכוזים. הדוגמאות מספקות אסמכתא שבאמצעותה ניתן להעריך את הביצועים ויכולת השכפול של בדיקות תוך ובין בדיקות.
Abstract
מבחני אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספקים תובנות חשובות על דפוסי ביטוי חלבונים, שהפרשנות המהימנה שלהם דורשת דגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. מאחר שפקדי רקמות או קו תאים מתאימים אינם תמיד זמינים, שיטה פשוטה ליצירת בקרות IHC סינתטיות עשויה להועיל. שיטה כזו מתוארת כאן. הוא ניתן להתאמה לסוגי אנטיגנים שונים, כולל חלבונים, פפטידים או אוליגונוקלאוטידים, במגוון רחב של ריכוזים. פרוטוקול זה מסביר את השלבים הדרושים ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות, תוך שימוש כדוגמה בפפטיד מהתחום התוך-תאי של אונקוגן אריתרובלסטי אנושי B2 (ERBB2/HER2) (ICD) המוכר על ידי מגוון נוגדנים רלוונטיים מבחינה אבחנתית. דילולים סדרתיים של פפטיד HER2 ICD בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) מעורבבים עם פורמלדהיד ומחוממים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס כדי להתמצק ולקשר את תערובת הפפטיד/BSA. ניתן לעבד, לחתוך ולהכתים את הג’ל שנוצר כמו רקמה, ולהניב סדרה של דגימות של ריכוזי אנטיגן ידועים המשתרעים על פני מגוון רחב של עוצמות צביעה.
פרוטוקול פשוט זה עולה בקנה אחד עם נהלי מעבדה היסטולוגיים שגרתיים. השיטה דורשת רק שלמשתמש תהיה כמות מספקת של האנטיגן הרצוי. חלבונים רקומביננטיים, תחומי חלבונים או פפטידים ליניאריים המקודדים אפיטופים רלוונטיים עשויים להיות מסונתזים באופן מקומי או מסחרי. מעבדות המייצרות נוגדנים פנימיים יכולות לשריין אליקוטים של האנטיגן המחסן כמטרה להדברה סינתטית. ההזדמנות ליצור בקרות חיוביות מוגדרות היטב במגוון רחב של ריכוזים מאפשרת למשתמשים להעריך את ביצועי הבדיקה התוך-מעבדתית והבין-מעבדתית, לקבל תובנה לגבי הטווח הדינמי והלינאריות של הבדיקות שלהם, ולמטב את תנאי הבדיקה למטרות הניסוי הספציפיות שלהם.
Introduction
אימונוהיסטוכימיה (IHC) מאפשרת זיהוי רגיש וספציפי ומדויק מרחבית של אנטיגנים מטרה בקטעי רקמות קבועים פורמלין, משובצי פרפין (FFPE). עם זאת, תוצאות צביעת IHC עשויות להיות מושפעות ממשתנים מרובים, כולל זמן איסכמיה חם וקר, קיבוע רקמות, טיפול מקדים ברקמות, תגובתיות וריכוז נוגדנים, כימיה של זיהוי בדיקה וזמני תגובה1. לפיכך, ביצועים ופרשנות הניתנים לשחזור של תגובות IHC דורשים שליטה קפדנית במשתנים אלה ושימוש בדגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. בקרות נפוצות כוללות רקמות משובצות פרפין או קווי תאים בתרבית הידועים מניתוחים עצמאיים כדי להביע את האנטיגן המעניין, אך דגימות כאלה לא תמיד זמינות1. יתר על כן, רמות הביטוי של אנטיגני המטרה ברקמות ובקרות קו התא מובנות בדרך כלל רק באופן איכותי ועשויות להיות משתנות. בקרות המכילות ריכוזים ידועים וידועים במדויק של אנטיגן מטרה יכולות לסייע באופטימיזציה של תנאי תגובת IHC. שיטה כללית, הניתנת להתאמה למגוון סוגי אנטיגנים בטווח ריכוזים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ליצירת דגימות בקרת IHC סינתטיות, תוארה על ידי המחברים2. פרוטוקול מפורט מסופק כאן ליצירה ושימוש בסוג זה של תקן.
בקרות מתאימות חיוניות לפרשנות תקפה של מבחני IHC 1,3,4. רקמות, תאים בתרבית ומצעים מצופים פפטידים שימשו כבקרות IHC בהתאם לצרכים הספציפיים של החוקרים. היתרונות והמגבלות הטמונים בשימוש ברקמות כבקרות IHC נדונו בהרחבה 1,4. עבור נוגדנים רבים, ניתן לבחור בקרות מתאימות מתוך רקמות נורמליות נבחרות המכילות אוכלוסיות תאים המבטאות את אנטיגן המטרה על פני טווח דינמי רחב. בקרות רקמות מתאימות פחות כאשר אנטיגן המטרה אינו מאופיין היטב לגבי אתר ביטוי או שפע, או כאשר אנטיגנים בעלי פוטנציאל לתגובה צולבת מתבטאים יחד באותם תאים או אתרי רקמה. בהקשרים אלה, בלוקים של קווי תאים בתרבית המבטאים את האנטיגן המעניין יכולים להיות מועילים. כדי לספק ראיות נוספות לספציפיות המטרה, ניתן להנדס את קווי התאים כך שאנטיגנים בעלי ביטוי יתר או תת-ביטוי. לדוגמה, גישה כזו שימשה לאחרונה להערכת מגוון של בדיקות נגד PD-L1 באמצעות מיקרו-מערך רקמה של קווי תאים איזוגניים המבטאים טווח של אנטיגן PD-L15. המגבלות המעשיות לשימוש השגרתי בבלוקים של קווי תאים כוללות את העלות והזמן הדרושים כדי לייצר מספרי תאים מספיקים ואת העובדה שהביטוי של אנטיגנים מסוימים עשוי שלא להיות עקבי באופן אמין, אפילו בתוך שורות תאי קלונל6. פפטידים סינתטיים הם אפשרות שלישית לבקרת IHC עבור נוגדנים המזהים אפיטופים ליניאריים קצרים. סטיבן בוגן ועמיתיו פרסמו בהרחבה על השימוש בפפטידים המוצמדים לפני השטח של שקופיות זכוכית 7,8 וחרוזי זכוכית9. מחקר אחד של קבוצה זו הראה כי ניתוח כמותי של בקרות IHC מבוססות פפטידים יכול לזהות שונות בתהליך הכתם שהוחמצה על ידי הערכה איכותית של בקרות רקמות שנותחו במקביל10. בעוד שתקנים המשתמשים באנטיגנים מבוססי חרוזים יכולים להיות ישימים באופן נרחב, פרטים רבים הם קנייניים עבור המחברים, ומגבילים אימוץ נרחב.
גישה נוספת לתקני IHC משלבת אנטיגנים ממוקדים בג’לים חלבוניים שנוצרו באופן מלאכותי. תפיסה זו הודגמה לראשונה על ידי פר ברנדצאג בשנת 1972 במחקר שבו סרום ארנבים רגיל עבר פולימריזציה באמצעות גלוטרלדהיד11. בלוקים קטנים של הג’ל שנוצר הושרו לאחר מכן במשך 1-4 שבועות בתמיסות המכילות את האנטיגנים האימונוגלובולינים המעניינים בריכוזים שונים. לאחר קיבוע אלכוהול והטבעת פרפין, חלקים מהפקדים שהתקבלו הוכתמו בעוצמות המתאימות ללוגריתם של תמיסות האנטיגן שבהן הושרו. מאוחר יותר, החוקרים הכינו צמדי גלוטארלדהיד של חומצות אמינו ספציפיות ב-BSA מדולל או בתמיסות הומוגנטיות במוח כבקרות חיוביות במחקרי מיקרוסקופיה חיסונית-אלקטרונית 12,13. עבודה עדכנית יותר בחנה את השימוש בג’לים העשויים מתמיסות חלבון קבועות פורמלדהיד כפונדקאיות עבור רקמת FFPE בניתוח ספקטרומטריית מסה14. עבודה נוספת שנערכה לאחרונה בחנה את המבנה והתכונות של ג’לים הנוצרים על ידי חימום תמיסות אלבומין בסרום אנושי או בקר בריכוזים שונים וב-pH15. מחברים אלה מצאו כי אלבומין בסרום יוצר שלושה סוגים של ג’לים הנבדלים זה מזה באלסטיות מכנית, בשימור מבנה משני וביכולת קשירת חומצות שומן בהתאם לתנאי הניסוי. יחד, מאמרים אלה מדגימים את ההיתכנות הכללית של הגישה הנהוגה כאן. תמיסות חלבונים בעלות הרכב מוגדר יוצרות ג’לים דמויי רקמה הניתנים לעיבוד, חתך והכתמה נוספים בשיטות היסטולוגיות שגרתיות.
פרוטוקול זה מתאר את היווצרותה של בקרת IHC סינתטית העשויה מאלבומין בסרום בקר (BSA) שעבר פולימריזציה בחום ובפורמלדהיד. הג’לים יכולים לשלב מגוון רחב של אנטיגנים, כולל חלבונים באורך מלא, תחומי חלבונים ופפטידים ליניאריים, כמו גם אנטיגנים שאינם חלבונים כולל אוליגונוקלאוטידים2. הדגמה זו משתמשת באנטיגן לדוגמה, פפטיד ליניארי המקודד את חומצות האמינו C-terminal 16 של חלבון ERBB2 (HER2/neu) האנושי TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ראו טבלת חומרים). רצף זה כולל את האפיטופים המוכרים על ידי שלושה נוגדנים זמינים מסחרית ורלוונטיים מבחינה אבחנתית, כולל המגיב הפוליקלונלי הרצפטי ביותר (ENPEYLGLDVP) והנוגדנים החד-שבטיים CB11 (AENPEYL) ו-4B5 (TAENPEYLGL) (ראו טבלת חומרים)16.
השיטה המודגמת כאן משתמשת בריאים בריאים בריאים ריאגנטים באמצעות תהליכים וטכניקות המוכרות לכל מעבדה היסטולוגית מתאמנת. המגבלה המשמעותית ביותר היא הצורך לזהות ולרכוש את האנטיגנים של היעד, דבר שניתן להשיג במקרים רבים בעלות צנועה יחסית. מכיוון שבקרות סינתטיות אלה הן בעלות הרכב מוגדר לחלוטין ועשויות בשיטות פשוטות, ניתן ליישם אותן במעבדות רבות עם תוצאות הניתנות לשחזור. השימוש בהם עשוי להקל על הערכה אובייקטיבית וניתנת לכימות של תוצאות צביעת IHC ולאפשר יכולת שכפול תוך-מעבדתית ובין-מעבדתית גדולה יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דגימות אחידות של הרכב ידוע וריכוז אנטיגן כסטנדרטים בתגובות IHC, תוך שימוש בחומרים ובטכניקות המוכרות לרוב מעבדות ההיסטולוגיה. הצעד המכריע ביותר הוא לזהות את האפיטופ שאליו נקשר הנוגדן בעל העניין. פרוטוקול זה מתאר שימוש באנטיגן פפטידי ליניארי מ-ERBB2/HER2 ICD. ניתן להשתמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לעמיתיהם ג’פרי טום ואימין סונג על סינתזת פפטידים, ל-Nianfeng Ge על בניית TMA, לשרי לאו על צביעת IHC, למליסה אדיק על סריקה מיקרוסקופית דיגיטלית, ול-Hai Ngu על כימות תמונה דיגיטלית.
Materials
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
Referências
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O’Leary, T. J., Mason, J. T. ‘Tissue surrogates’ as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
