İmmünohistokimya için Sentetik Antijen Kontrolleri
Summary
Bu çalışma, immünohistokimya için sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntemi belgelemektedir. Teknik, çok çeşitli konsantrasyonlarda çeşitli antijenlere uyarlanabilir. Numuneler, tahlil içi ve tahliller arası performansı ve tekrarlanabilirliği değerlendirmek için bir referans sağlar.
Abstract
İmmünohistokimya (IHC) testleri, güvenilir yorumu iyi karakterize edilmiş pozitif ve negatif kontrol örnekleri gerektiren protein ekspresyon paternleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Uygun doku veya hücre hattı kontrolleri her zaman mevcut olmadığından, sentetik IHC kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntem faydalı olabilir. Böyle bir yöntem burada açıklanmıştır. Çok çeşitli konsantrasyonlarda proteinler, peptitler veya oligonükleotidler dahil olmak üzere çeşitli antijen tiplerine uyarlanabilir. Bu protokol, sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için gerekli adımları açıklamakta, örnek olarak çeşitli tanısal olarak ilgili antikorlar tarafından tanınan insan eritroblastik onkogen B2 (ERBB2 / HER2) hücre içi alanından (ICD) bir peptid kullanmaktadır. Sığır serum albümini (BSA) çözeltisindeki HER2 ICD peptidinin seri seyreltimleri formaldehit ile karıştırılır ve peptid / BSA karışımını katılaştırmak ve çapraz bağlamak için 85 ° C’de 10 dakika ısıtılır. Elde edilen jel, bir doku gibi işlenebilir, kesitlenebilir ve boyanabilir, böylece çok çeşitli boyama yoğunluklarını kapsayan bilinen antijen konsantrasyonlarında bir dizi örnek elde edilebilir.
Bu basit protokol rutin histoloji laboratuarı prosedürleri ile tutarlıdır. Yöntem sadece kullanıcının istenen antijenden yeterli miktarda olmasını gerektirir. İlgili epitopları kodlayan rekombinant proteinler, protein alanları veya doğrusal peptitler lokal veya ticari olarak sentezlenebilir. Kurum içi antikorlar üreten laboratuvarlar, bağışıklayıcı antijenin alikotlarını sentetik kontrol hedefi olarak rezerve edebilir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda iyi tanımlanmış pozitif kontroller oluşturma fırsatı, kullanıcıların laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tahlil performansını değerlendirmelerine, tahlillerinin dinamik aralığı ve doğrusallığı hakkında fikir edinmelerine ve tahlil koşullarını belirli deneysel hedefleri için optimize etmelerine olanak tanır.
Introduction
İmmünohistokimya (IHC), formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku kesitlerinde hedef antijenlerin hassas ve spesifik, mekansal olarak hassas tespitini sağlar. Bununla birlikte, IHC boyama sonuçları, sıcak ve soğuk iskemi süresi, doku fiksasyonu, doku ön tedavisi, antikor reaktivitesi ve konsantrasyonu, tahlil tespit kimyası vereaksiyon süreleri 1 dahil olmak üzere birçok değişkenden etkilenebilir. Buna göre, tekrarlanabilir performans ve IHC reaksiyonlarının yorumlanması, bu değişkenlerin sıkı kontrolünü ve iyi karakterize edilmiş pozitif ve negatif kontrol örneklerinin kullanılmasını gerektirir. Sık kullanılan kontroller, ilgilenilen antijeni ifade etmek için bağımsız analizlerden bilinen parafin gömülü dokuları veya kültürlenmiş hücre hatlarını içerir, ancak bu tür örnekler her zaman mevcut değildir1. Ayrıca, hedef antijenlerin dokulardaki ekspresyon düzeyleri ve hücre hattı kontrolleri genellikle sadece kalitatif olarak anlaşılır ve değişken olabilir. Tekrarlanabilir, kesin olarak bilinen hedef antijen konsantrasyonlarını içeren kontroller, IHC reaksiyon koşullarının optimizasyonuna yardımcı olabilir. Sentetik IHC kontrol numuneleri oluşturmak için fizyolojik olarak ilgili bir konsantrasyon aralığında çeşitli antijen tiplerine uyarlanabilen genel bir yöntem, yazarlar tarafından tanımlanmıştır2. Bu tür bir standardın oluşturulması ve kullanılması için burada ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.
IHC tahlilleri 1,3,4’ün geçerli yorumlanması için uygun kontroller şarttır. Dokular, kültürlenmiş hücreler ve peptit kaplı substratlar, araştırmacıların özel ihtiyaçlarına göre IHC kontrolleri olarak kullanılmıştır. Dokuların İHH kontrolleri olarak kullanılmasının doğasında var olan avantajlar ve sınırlamalar kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır 1,4. Birçok antikor için, geniş bir dinamik aralıkta hedef antijeni eksprese eden hücre popülasyonlarını içeren seçilmiş normal dokulardan uygun kontroller seçilebilir. Doku kontrolleri, hedef antijen ekspresyon bölgesi veya bolluğu ile ilgili olarak iyi karakterize edilmediğinde veya potansiyel olarak çapraz reaksiyona giren antijenler aynı hücrelerde veya doku bölgelerinde birlikte eksprese edildiğinde daha az uygundur. Bu bağlamlarda, ilgilenilen antijeni ifade eden kültürlenmiş hücre hatları blokları yardımcı olabilir. Hedef özgüllüğüne dair daha fazla kanıt sağlamak için, hücre hatları hedef antijenleri aşırı veya az eksprese edecek şekilde tasarlanabilir. Örneğin, böyle bir yaklaşım yakın zamanda, bir dizi PD-L1 antijeni5’i eksprese eden izojenik hücre hatlarından oluşan bir doku mikrodizisi kullanarak çeşitli anti-PD-L1 tahlillerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Hücre hattı bloklarının rutin kullanımındaki pratik sınırlamalar, yeterli hücre sayıları üretmek için gereken maliyet ve zamanı ve bazı antijenlerin ekspresyonunun, klonal hücre hatları6 içinde bile güvenilir bir şekilde tutarlı olmayabileceği gerçeğini içerir. Sentetik peptitler, kısa lineer epitopları tanıyan antikorlar için IHC kontrolleri için üçüncü bir seçenektir. Steven Bogen ve meslektaşları, cam slaytların 7,8 ve cam boncukların 9 yüzeyine bağlanmış peptitlerin kullanımı hakkında kapsamlı bir şekilde yayınyaptılar. Bu grup tarafından yapılan bir çalışma, peptid bazlı IHC kontrollerinin kantitatif analizinin, paralel10’da analiz edilen doku kontrollerinin kalitatif değerlendirmesi ile kaçırılan boyama süreci varyasyonunu tespit edebileceğini göstermiştir. Boncuk bazlı antijenleri kullanan standartlar yaygın olarak uygulanabilirken, birçok ayrıntı yazarlara aittir ve yaygın olarak benimsenmesini sınırlar.
IHC standartlarına bir başka yaklaşım, hedef antijenleri yapay olarak oluşturulan protein jellerine dahil eder. Bu kavram ilk olarak 1972 yılında Per Brandtzaeg tarafından normal tavşan serumunun glutaraldehit11 kullanılarak polimerize edildiği bir çalışmada gösterilmiştir. Elde edilen jelin küçük blokları daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda ilgilenilen immünoglobulin antijenlerini içeren çözeltilerde 1-4 hafta bekletildi. Alkol fiksasyonu ve parafin gömülmesinden sonra, ortaya çıkan kontrollerin bölümlerinin, ıslatıldıkları antijen çözeltilerinin logaritmasına karşılık gelen yoğunluklarda lekelendiği gösterilmiştir. Daha sonra, araştırmacılar immün-elektron mikroskobu çalışmalarında pozitif kontroller olarak seyreltik BSA veya beyin homojenat çözeltilerinde spesifik amino asitlerin glutaraldehit konjugatlarını hazırladılar12,13. Daha yeni çalışmalar, formaldehit sabit protein çözeltilerinden yapılan jellerin, kütle spektrometrisi analizinde FFPE dokusu için vekil olarak kullanımını araştırdı14. Son zamanlarda yapılan bir başka çalışmada, insan veya sığır serum albümin çözeltilerinin çeşitli konsantrasyonlarda ve pH15’te ısıtılmasıyla oluşan jellerin yapısı ve özellikleri araştırılmıştır. Bu yazarlar, serum albüminin, deneysel koşullara bağlı olarak mekanik elastikiyet, ikincil yapı koruması ve yağ asidi bağlama kabiliyeti bakımından farklılık gösteren üç tip jel oluşturduğunu bulmuşlardır. Birlikte, bu makaleler burada kullanılan yaklaşımın genel fizibilitesini göstermektedir. Tanımlanmış bileşimin protein çözeltileri, rutin histolojik yöntemler kullanılarak daha fazla işlenebilen, kesitlenebilen ve boyanabilen doku benzeri jeller oluşturur.
Bu protokol, ısı ve formaldehit ile polimerize edilmiş sığır serum albümininden (BSA) yapılan sentetik bir IHC kontrolünün oluşumunu tanımlar. Jeller, tam uzunlukta proteinler, protein alanları ve doğrusal peptitlerin yanı sıra oligonükleotidler2 dahil olmak üzere protein olmayan antijenler de dahil olmak üzere çok çeşitli antijenleri içerebilir. Bu gösterim, insan ERBB2 (HER2 / neu) proteini TPTAENPEYLGLDVPV-COOH’un C-terminal 16 amino asitlerini kodlayan bir doğrusal peptit örneği antijen kullanmaktadır (bkz. Bu sekans, Herceptest poliklonal reaktifi (ENPEYLGLDVP) ve monoklonal antikorlar CB11 (AENPEYL) ve 4B5 (TAENPEYLGL) dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen, tanısal olarak ilgili üç antikor tarafından tanınan epitopları içerir (bakınız Malzeme Tablosu)16.
Burada gösterilen yöntem, herhangi bir pratik histoloji laboratuvarına aşina olan süreçleri ve teknikleri kullanarak hazır bulunan reaktifleri kullanır. En önemli sınırlama, birçok durumda nispeten mütevazı bir maliyetle gerçekleştirilebilecek hedef antijenleri tanımlama ve satın alma ihtiyacıdır. Bu sentetik kontroller tamamen tanımlanmış bileşime sahip olduğundan ve basit yöntemlerle yapıldığından, birçok laboratuvarda tekrarlanabilir sonuçlarla uygulanabilirler. Bunların kullanımı, IHC boyama sonuçlarının objektif, ölçülebilir değerlendirmesini kolaylaştırabilir ve laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası daha fazla tekrarlanabilirlik sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, kullanıcının çoğu histoloji laboratuvarına aşina olan malzeme ve teknikleri kullanarak, IHC reaksiyonlarında standart olarak bilinen bileşim ve antijen konsantrasyonunun tek tip numunelerini oluşturmasına olanak tanır. En önemli adım, ilgilenilen antikorun bağlandığı epitopu tanımlamaktır. Bu protokol, ERBB2 / HER2 ICD’den doğrusal bir peptid antijeninin kullanılmasını açıklar. Aynı protokol, oligonükleotidler, floresan etiketler, protein alanları veya tam uzunlukta proteinler iç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, peptid sentezi için meslektaşları Jeffrey Tom ve Aimin Song’a, TMA yapımı için Nianfeng Ge’ye, IHC boyama için Shari Lau’ya, dijital mikroskobik tarama için Melissa Edick’e ve dijital görüntü ölçümü için Hai Ngu’ya minnetle teşekkür ediyor.
Materials
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
Referências
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O’Leary, T. J., Mason, J. T. ‘Tissue surrogates’ as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
