يستخدم هذا البروتوكول تورم الآجاروز كتقنية قوية وقابلة للتعميم لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) في الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة (GUVs) ، كما هو موضح هنا لإعادة تشكيل بروتين مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) ، وهي واحدة من فئات مستقبلات G ذات الأهمية الدوائية المقترنة بالبروتين.
كانت التحقيقات القوية في المختبر لهيكل ووظيفة بروتينات الغشاء المتكاملة تحديا بسبب تعقيدات غشاء البلازما والعوامل العديدة التي تؤثر على سلوك البروتين في الخلايا الحية. الحويصلات العملاقة unilamellar (GUVs) هي نظام نموذج محاكاة حيوية وغير قادر للغاية في المختبر للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والغشاء والتحقيق في سلوك البروتين بطريقة دقيقة تعتمد على التحفيز. في هذا البروتوكول, نقدم طريقة غير مكلفة وفعالة لتصنيع GUVs مع مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) متكاملة بشكل ثابت في الغشاء. نحن تصنيع GUVs باستخدام طريقة تورم الهيدروجيل المعدلة; عن طريق إيداع فيلم الدهون على رأس خليط من الآغاروز و 5-HT1AR ومن ثم ترطيب النظام بأكمله، يمكن تشكيل الحويصلات مع موجهة بشكل صحيح والوظيفية 5-HT1AR دمجها في الغشاء. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه GUVs لفحص التفاعلات بين البروتين والأغشية وسلوك التعريب عن طريق المجهر. في نهاية المطاف ، يمكن لهذا البروتوكول تعزيز فهمنا لوظيفة بروتينات الأغشية المتكاملة ، مما يوفر رؤية فسيولوجية عميقة.
الأغشية الاصطناعية النموذجية هي أدوات قوية في التحقيق في الخصائص والوظائف الأساسية للأغشية الحيوية. الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة مجموعة متنوعة من خصائص غشاء البلازما ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة1،2،3،4،5،6،7،8. ومن الثابت أن غشاء البلازما وتنظيمه يلعبان دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية، مثل نقل الإشارات، والالتصاق، وداء الغدد الصماء، والنقل9،10،11،12،13،14،15.
وقد تم تصنيع GUVs باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الترطيب لطيف16، تورم الهيدروجيل17، التشكيل الكهربائي18، تقنيات microfluidic19،20،21،22، jetting23، وتبادل المذيبات24،25،26. بسبب التحديات في التعامل مع بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) ، كانت منصات المختبر لمدرستها محدودة. تقدم GUVs منصة مبسطة لدراسة IMPs في بيئة تحاكي بيئتها الأصلية. على الرغم من وجود العديد من النهج لإعادة تشكيل البروتين في GUVs ، تنشأ تحديات من دمج البروتينات مع التوجه الصحيح والحفاظ على وظائف البروتين27.
تتطلب إعادة تشكيل البروتين الأكثر نجاحا في GUVs طريقة تبادل المنظفات؛ الذي ينطوي على solubilizing البروتينات من بيئتها الأصلية من المنظفات، تليها تنقية البروتين، ومن ثم استبدال جزيئات المنظفات مع الدهون من خلال أساليب مختلفة28. في حين أن المنظفات تعمل على تثبيت الهيكل الثالث ل IMPs أثناء التطهير ، فإن ميقات المنظفات هي بيئة غير طبيعية نسبيا لهذه البروتينات ، والتي يتم تثبيتها بشكل أفضل ، خاصة للدراسات الوظيفية ، في ثنائيات الطبقات الدهنية28،29،30. وعلاوة على ذلك، كان من الصعب دمج بروتينات ترانسممبران الوظيفية في طبقة الدهون باستخدام تقنيات تصنيع GUV التقليدية بسبب الحجم، وحساسية هذه البروتينات، وخطوات تبادل المنظفات الإضافية التي ستكون مطلوبة27،31،32،33. استخدام المذيبات العضوية لإزالة المنظفات يسبب تجميع البروتين وإزالة التورينج34. وقد تم تحسين طريقة بوساطة المنظفات واعدة، ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر لخطوة إزالة المنظفات والتحسين قد تكون هناك حاجة لبروتينات محددة31،35. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحد الطرق التي تستخدم التشكيل الكهربائي من اختيار البروتين وقد لا تكون مناسبة لجميع التراكيب الدهنية وخاصة الدهون المشحونة31,36,37. تقنية أخرى تم استخدامها هي الانصهار الناجم عن الببتيد من الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) التي تحتوي على البروتين المطلوب مع GUVs ، على الرغم من أنه وجد أن تكون شاقة ويمكن أن تؤدي إلى إدراج جزيئات غريبة – الببتيدات fusogenic333،38،39. يمكن استخدام الحويصلات العملاقة لغشاء البلازما (GPMVs) ، المشتقة من الخلايا الحية ، للتغلب على بعض هذه القضايا ، ومع ذلك فهي تسمح بالحد الأدنى من التحكم في تكوين الدهون والبروتين الناتج14،40،41. لذلك ، فإن دمج IMPs في طبقة ثنائية الدهون من GUVs باستخدام طريقة تورم الآغروز المعدلة لدينا يقدم طريقة موثوقة لمواصلة فحص هذه البروتينات في بيئة الغشاء42،43،44،45.
الإشارات الخلوية والاتصالات ينطوي على عائلة من البروتينات المعروفة باسم مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs); GPCRs هي من بين أكبر عائلة من البروتينات وترتبط مع تعديل المزاج والشهية وضغط الدم ووظيفة القلب والأوعية الدموية والتنفس والنوم بين العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى46. في هذه الدراسة, استخدمنا مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) وهو عضو نموذجي في الأسرة GPCR. 5-HT1AR يمكن العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والأوعية الدموية. فإنه يؤثر على العديد من الوظائف مثل القلب والأوعية الدموية، الجهاز الهضمي، وظائف الغدد الصماء، فضلا عن المشاركة في تنظيم mood47. ينشأ حاجز كبير أمام أبحاث GPCR من بنيتها البرمائية المعقدة ، وتوفر GUVs منصة واعدة للتحقيق في الخصائص المختلفة ذات الاهتمام ، بدءا من وظائف البروتين ، والتفاعلات بين البروتين الدهني والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. وقد استخدمت نهج مختلفة لدراسة التفاعلات بين البروتين الدهني مثل الرنين السطحي البلازمون (SPR)48,49، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)50,51، تراكب الدهون البروتينية (PLO) المقايسة51,52,53,54، قياس الطيف الكتلي الأصلي55، قياس حراري المعايرة الحرارية (ITC)56,57، والليبوسوم الترسيب المقايسة58,59. وقد استخدم مختبرنا نهج GUV المبسط للتحقيق في تأثير التفاعلات بين البروتين الدهني على وظائف البروتين عن طريق تحفيز BODIPY-GTPοS ، الذي يرتبط مع وحدة Giα الفرعية في الحالة النشطة للمستقبلات. ويفك ربطها الفلوروفور الذي ينتج إشارة مضانة يمكن اكتشافها بمرور الوقت45. وعلاوة على ذلك، حققت دراسات مختلفة في التفاعلات بين البروتين الدهني ودور البروتينات في استشعار أو تثبيت انحناء الأغشية60,61، ويمكن أن يكون استخدام نهج GUV الممكن ميزة رئيسية.
يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة لدمج GPCRs في غشاء GUVs باستخدام نظام agarose هيدروجيل معدل17,42. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى عملنا السابق، يمكن أن تكون طريقتنا مناسبة لIMPs التي يمكن أن تحمل التعرض على المدى القصير إلى 30-40 درجة مئوية. باختصار، ونحن نشر فيلم رقيقة من الآغاروز جنبا إلى جنب مع شظايا الغشاء التي تحتوي على GPCR من الفائدة. بعد هلام هذه الطبقة، ونحن إيداع محلول الدهون فوق agarose والسماح للمذيب لتتبخر. ثم تم تنفيذ الإماهة للنظام مع عازل مائي، مما أدى إلى تشكيل GUVs مع البروتين المدرجة في طبقة ثنائية الدهون.
لقد حددنا خطوتين حاسمتين لنجاح البروتوكول العام: علاج البلازما وترسب الدهون. تنظيف البلازما ينجز شيئين: أولا، فإنه يزيل آثار المواد العضوية من سطح الزجاج. ثانيا، فإنه ينشط سطح الغطاء، مما يسمح لزيادة في wettability كما يزيد hydrophilicity سطح الزجاج62،63. لمس سطح coverlip تن?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ماثيو بلوسر على النقاش والمشورة القيمة. وقد دعم هذا العمل مكتب البحوث البحرية (N00014-16-1-2382) والمؤسسة الوطنية للعلوم (PHY-1915017).
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |