Konstruktion von Modelllipidmembranen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)

Summary

Dieses Protokoll nutzt die Agaroseschwellung als eine leistungsfähige und generalisierbare Technik zum Einbau von integralen Membranproteinen (IMPs) in riesige unilamellare Lipidvesikel (GUVs), wie hier für die Rekonstitution des menschlichen 1A-Serotoninrezeptorproteins (_5-HT1AR), einer der Klassen pharmakologisch wichtiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, beschrieben.

Abstract

Robuste In-vitro-Untersuchungen der Struktur und Funktion integraler Membranproteine waren aufgrund der Komplexität der Plasmamembran und der zahlreichen Faktoren, die das Proteinverhalten in lebenden Zellen beeinflussen, eine Herausforderung. Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) sind ein biomimetisches und hochgradig abstimmbares in vitro Modellsystem zur Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen und zur genauen, reizabhängigen Untersuchung des Proteinverhaltens. In diesem Protokoll stellen wir eine kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von GUVs mit dem menschlichen Serotonin-1A-Rezeptor (_5-HT1AR) vor, der stabil in die Membran integriert ist. Wir stellen GUVs mit einer modifizierten Hydrogel-Quellmethode her; Durch Abscheiden eines Lipidfilms auf einer Mischung aus Agarose und _5-HT1AR und anschließender Hydratisierung des gesamten Systems können Vesikel mit richtig ausgerichtetem und funktionellem _5-HT1AR gebildet werden, das in die Membran eingebaut ist. Diese GUVs können dann verwendet werden, um Protein-Membran-Interaktionen und das Lokalisierungsverhalten mittels Mikroskopie zu untersuchen. Letztendlich kann dieses Protokoll unser Verständnis der Funktionalität integraler Membranproteine verbessern und fundierte physiologische Erkenntnisse liefern.

Introduction

Synthetische Modellmembranen sind leistungsfähige Werkzeuge bei der Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften und Funktionen von Biomembranen. Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) sind eine der bekanntesten Plattformen zur Untersuchung einer Vielzahl von Plasmamembraneigenschaften und können so konstruiert werden, dass sie verschiedene physiologische Bedingungen nachahmen1,2,3,4,5,6,7,8. Es ist allgemein bekannt, dass die Plasmamembran und ihre Organisation eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen spielen, wie Signaltransduktion, Adhäsion, Endozytose und Transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs wurden mit verschiedenen Methoden hergestellt, darunter sanfte ^{Hydratation16}, Hydrogelquellung17, ^{Elektroformation18}, mikrofluidische Techniken19,20,21,22, ^Jetting23 und Lösungsmittelaustausch24,25,26. Aufgrund der Herausforderungen beim Umgang mit integralen Membranproteinen (IMPs) waren die In-vitro-Plattformen, um sie zu untersuchen, begrenzt. GUVs bieten eine vereinfachte Plattform für die Untersuchung von IMPs in einer Umgebung, die ihre native Umgebung nachahmt. Obwohl es mehrere Ansätze für die Proteinrekonstitution in GUVs gibt, ergeben sich Herausforderungen aus der Integration von Proteinen mit der richtigen Ausrichtung und der Aufrechterhaltung der ^{Proteinfunktionalität27}.

Die erfolgreichste Proteinrekonstitution in GUVs erfordert die Waschmittelaustauschmethode; Dabei werden die Proteine aus ihrer nativen Umgebung durch Detergenzien gelöst, gefolgt von einer Proteinreinigung, und dann die Waschmittelmoleküle durch Lipide durch verschiedene Methoden ^ersetzt28. Während Detergenzien dazu dienen, die tertiäre Struktur von IMP während der Reinigung zu stabilisieren, sind Waschmittelmizellen eine relativ unnatürliche Umgebung für diese Proteine, die insbesondere für funktionelle Studien in Lipiddoppelschichten besser stabilisiert werden28,29,30. Darüber hinaus war die Integration funktioneller Transmembranproteine in die Lipiddoppelschicht mit herkömmlichen GUV-Herstellungstechniken aufgrund der Größe, der Zartheit dieser Proteine und der zusätzlichen Waschmittelaustauschschritte, die erforderlich ^{wären, schwierig27,31,32,33}. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln zur Entfernung von Detergenzien verursacht Proteinaggregation und ^{Denaturierung34}. Eine verbesserte waschmittelvermittelte Methode war vielversprechend, jedoch ist Vorsicht beim Reinigungsschritt geboten, und für bestimmte Proteine könnte eine Optimierung erforderlich ^sein31,35. Darüber hinaus könnten Methoden, die Elektroformation verwenden, die Wahl des Proteins einschränken und sind möglicherweise nicht für alle Lipidzusammensetzungen, insbesondere geladene Lipide^{, geeignet31,36,37}. Eine andere Technik, die verwendet wurde, ist die peptidinduzierte Fusion von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs), die das gewünschte Protein mit GUVs enthalten, obwohl es sich als mühsam erwiesen hat und zur Insertion von Fremdmolekülen führen kann – den fusogenen Peptiden33,38,39. Riesige Plasmamembranvesikel (GPMVs), die aus lebenden Zellen gewonnen werden, können verwendet werden, um einige dieser Probleme zu überwinden, aber sie ermöglichen eine minimale Kontrolle der resultierenden Lipid- und Proteinzusammensetzung14,40,41. Daher stellt die Integration von IMP in die Bilipidschicht von GUVs unter Verwendung unserer modifizierten Agarose-Quellmethode eine zuverlässige Methode dar, um diese Proteine in der Membranumgebung weiter zu untersuchen42,43,44,45.

Zelluläre Signalisierung und Kommunikation umfasst eine Familie von Proteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bekannt sind. GPCRs gehören zur größten Familie von Proteinen und sind mit der Modulation von Stimmung, Appetit, Blutdruck, Herz-Kreislauf-Funktion, Atmung und Schlaf unter vielen anderen physiologischen Funktionen ^verbunden46. In dieser Studie verwendeten wir den menschlichen Serotonin-1A-Rezeptor (_5-HT1AR), der ein prototypisches Mitglied der GPCR-Familie ist. _5-HT1AR kann im zentralen Nervensystem (ZNS) und blutgefäßen gefunden werden; es beeinflusst zahlreiche Funktionen wie kardiovaskuläre, gastrointestinale, endokrine Funktionen sowie die Beteiligung an der Regulation der ^Stimmung47. Eine große Barriere für die GPCR-Forschung ergibt sich aus ihrer komplexen amphiphilen Struktur, und GUVs stellen eine vielversprechende Plattform für die Untersuchung verschiedener interessanter Eigenschaften dar, die von Proteinfunktionalität, Lipid-Protein-Interaktionen und Protein-Protein-Interaktionen reichen. Verschiedene Ansätze wurden verwendet, um Lipid-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)^48,49, Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)^50,51, Proteinlipid-Overlay (PLO)-Assay51,52,53,54, native Massenspektrometrie55, isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)^56,57 und Liposom ^{Sedimentationstest58,59}. Unser Labor hat den vereinfachten GUV-Ansatz verwendet, um die Wirkung von Lipid-Protein-Interaktionen auf die Proteinfunktionalität zu untersuchen, indem BODIPY-GTPγS eingeschlossen wurde, das im aktiven Zustand des Rezeptors an die _{Giα-Untereinheit} bindet. Ihre Bindung löst das Fluorophor und erzeugt ein Fluoreszenzsignal, das im Laufe der Zeit nachgewiesen werden ^könnte45. Darüber hinaus untersuchten verschiedene Studien Lipid-Protein-Interaktionen und die Rolle von Proteinen bei der Erfassung oder Stabilisierung der Membrankrümmung60,61, und die Verwendung eines praktikablen GUV-Ansatzes könnte ein entscheidender Vorteil sein.

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Integration von GPCRs in die Membran von GUVs unter Verwendung eines modifizierten Agarose-Hydrogel-Systems17,42. Darüber hinaus könnte unsere Methode auf der Grundlage unserer bisherigen Arbeiten für IMP geeignet sein, die ein kurzfristiges Engagement bei 30-40 °C aushalten können. Kurz gesagt, wir verteilen einen dünnen Film aus Agarose in Kombination mit Membranfragmenten, die die GPCR von Interesse enthalten. Nach dem Gelieren dieser Schicht legen wir eine Lipidlösung auf der Agarose ab und lassen das Lösungsmittel verdampfen. Die Rehydratation des Systems wurde dann mit einem wässrigen Puffer durchgeführt, was zur Bildung von GUVs mit Protein führte, das in die Lipiddoppelschicht eingebaut war.

Protocol

1. Proteinkennzeichnung Lassen Sie NHS-Rhodamin, 5-HT1A-Membranfragmente und eine 7 K MWCO-Spinentsalzungssäule bei Raumtemperatur ausgleichen. 1 mg NHS-Rhodamin in 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Fügen Sie 5 μL 1 M Natriumbicarbonatlösung hinzu, um den pH-Wert der 5-HT1AR-Lösung auf einen pH-Wert von 8 zu erhöhen. 3,66 μL der NHS-Rhodaminlösung zu 50 μL der 5-HT1AR-Lösung geben und in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig …

Representative Results

Die Proteinkonzentration wurde gemessen und der Grad der Markierung wurde als molares Verhältnis zwischen dem Farbstoff und dem Protein auf 1:1 berechnet. Durch die Untersuchung der GUVs mittels konfokaler Mikroskopie konnten wir die erfolgreiche Bildung und Proteinintegration der Vesikel bestätigen. Die Lipide wurden mit 0,4 Mol-% ATTO 488-DPPE markiert, und das Protein wurde kovalent über rhodaminische NHS-Ester-Modifikation von primären Aminen markiert. Abbildung 2a und <strong class=…

Discussion

Wir haben zwei Schritte identifiziert, die für den Erfolg des Gesamtprotokolls entscheidend sind: Plasmabehandlung und Lipidablagerung. Die Plasmareinigung der Deckgläser ist unerlässlich, um eine ausreichende Abdeckung und Haftung des Agarose-Hydrogels auf dem Glasdeckglas zu gewährleisten. Die Plasmareinigung bewirkt zwei Dinge: Erstens entfernt sie Spuren organischer Substanz von der Glasoberfläche; Zweitens aktiviert es die Deckglasoberfläche, was eine Erhöhung der Benetzbarkeit ermöglicht, wenn die Hydrophil…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882