Konstruktion af Model Lipid Membraner indarbejde G-protein koblede receptorer (GPCRs)

Summary

Denne protokol udnytter agarose hævelse som en kraftfuld og generaliserbar teknik til at indarbejde integrerede membranproteiner (IMP) i gigantiske unilamellar lipid vesikler (GUVs), som beskrevet her for rekonstitution af human 1A serotonin receptor protein (_5-HT1AR), en af klasserne af farmakologisk vigtige G protein-koblede receptorer.

Abstract

Robuste in vitro-undersøgelser af strukturen og funktionen af integrerede membranproteiner har været en udfordring på grund af plasmamembranens kompleksitet og de mange faktorer, der påvirker proteinadfærden i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og meget tunable in vitro-modelsystem til undersøgelse af protein-membraninteraktioner og sondering af proteinadfærd på en præcis, stimulusafhængig måde. I denne protokol præsenterer vi en billig og effektiv metode til fremstilling af GUVs med den menneskelige serotonin 1A receptor (_5-HT1AR) stabilt integreret i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjælp af en modificeret hydrogel hævelse metode; ved at deponere en lipidfilm oven på en blanding af agarose og _5-HT1AR og derefter fugte hele systemet, kan vesikler dannes med korrekt orienteret og funktionel 5-HT1AR indarbejdet i membranen. Disse GUV’er kan derefter bruges til at undersøge protein-membran interaktioner og lokalisering adfærd via mikroskopi. I sidste ende kan denne protokol fremme vores forståelse af funktionaliteten af integrerede membranproteiner, hvilket giver dyb fysiologisk indsigt.

Introduction

Syntetiske modelmembraner er kraftfulde værktøjer i undersøgelsen af biomembranernes grundlæggende egenskaber og funktioner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en af de mest fremtrædende platforme til at studere en række plasmamembranegenskaber og kan konstrueres til at efterligne forskellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er veletableret, at plasmamembranen og dens organisation spiller en central rolle i en lang række cellulære processer, såsom signaltransduktion, vedhæftning, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs er blevet fremstillet ved hjælp af forskellige metoder, herunder blid ^hydrering16, hydrogel ^hævelse17, ^{elektroformation18}, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, ^jetting23, og opløsningsmiddel udveksling24,25,26. På grund af udfordringer med håndtering af integrerede membranproteiner (IMP) har in vitro-platforme til at studere dem været begrænsede. GUV’er præsenterer en forenklet platform til at studere IMP i et miljø, der efterligner deres oprindelige miljø. Selv om der har været flere tilgange til proteinkonstitution i GUV’er, opstår der udfordringer ved at inkorporere proteiner med den korrekte orientering og opretholde ^{proteinfunktionalitet27}.

Den mest vellykkede proteinkonkonstitution i GUV’er kræver vaskemiddeludvekslingsmetoden; som indebærer at opløse proteinerne fra deres oprindelige miljø ved rengøringsmidler, efterfulgt af proteinrensning, og derefter erstatte vaskemiddelmolekylerne med lipider gennem forskellige ^metoder28. Mens vaskemidler tjener til at stabilisere den tertiære struktur af IMP under rensning, vaskemiddel micelles er et relativt unaturligt miljø for disse proteiner, som er bedre stabiliseret, især for funktionelle undersøgelser, i lipid bilayers28,29,30. Desuden har det været vanskeligt at inkorporere funktionelle transmembranproteiner i lipid-bilayeren ved hjælp af traditionelle GUV-fremstillingsteknikker på grund af størrelsen, delikatessen af disse proteiner og de ekstra vaskemiddeludvekslingstrin, der ville være ^{nødvendige27,31,32,33}. Brugen af organisk opløsningsmiddel til at fjerne rengøringsmidler forårsager protein aggregering og ^{denaturering34}. En forbedret vaskemiddelmedieret metode har været lovende, men forsigtighed er nødvendig for vaskemiddel fjernelse trin og optimering kan være nødvendig for specifikke ^{proteiner31,35}. Derudover, metoder, der udnytter elektroformation kunne begrænse valget af protein og kan ikke være egnet til alle lipid kompositioner særligt ladede lipider31,36,37. En anden teknik, der er blevet brugt, er peptid-induceret fusion af store unilamellar vesikler (LUVs), der indeholder det ønskede protein med GUVs, selv om det viste sig at være besværligt og kan føre til indsættelse af udenlandske molekyler-fusogenic peptider33,38,39. Giant plasmamembran vesikler (GPMVs), som er afledt af levende celler, kan bruges til at overvinde nogle af disse spørgsmål, men de giver minimal kontrol af den resulterende lipid og protein sammensætning14,40,41. Derfor udgør integrationen af IMP i bilipidlaget af GUV’er ved hjælp af vores modificerede agarose hævelsesmetode en pålidelig metode til yderligere at undersøge disse proteiner i membranmiljøet42,43,44,45.

Cellulær signalering og kommunikation involverer en familie af proteiner kendt som G protein-koblede receptorer (GPCRs); GPCR er blandt de største familie af proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetit, blodtryk, hjerte-kar-funktion, åndedræt, og søvn blandt mange andre fysiologiske ^funktioner46. I denne undersøgelse, Vi brugte human serotonin 1A receptor (_5-HT1AR), som er et prototypisk medlem af GPCR familien. _5-HT1AR kan findes i centralnervesystemet (CNS) og blodkar; det påvirker mange funktioner såsom hjerte-kar-, gastrointestinale, endokrine funktioner, samt deltager i reguleringen af ^mood47. En stor barriere for GPCR forskning stammer fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVs præsentere en lovende platform for undersøgelsen af forskellige egenskaber af interesse, lige fra protein funktionalitet, lipid-protein interaktioner, og protein-protein interaktioner. Forskellige tilgange er blevet brugt til at studere lipid-protein interaktioner såsom overflade plasmon resonans (SPR)^48,49, nuklear magnetisk resonans spektroskopi (NMR)^50,51, protein lipid overlay (PLO) ^{assay51,52,53,54}, native massespektrometri55, isotermisk titrering calorimetri (ITC) ^56,57, og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Vores laboratorium har brugt den forenklede GUV-tilgang til at undersøge effekten af lipid-protein interaktioner på proteinfunktionalitet ved at indkapsle BODIPY-GTPγS, som binder sig til _{Giα-underenheden} i receptorens aktive tilstand. Deres bindende løsner fluorophoren, der producerer et fluorescenssignal, der kunne detekteres over ^tid45. Desuden undersøgte forskellige undersøgelser Lipid-protein interaktioner og proteiners rolle i at mærke eller stabilisere membrankrumningen60,61, og ved hjælp af en mulig GUV-tilgang kunne det være en vigtig fordel.

Denne protokol viser en enkel metode til at indarbejde GPCR’er i membranen af GUV’er ved hjælp af et modificeret agarose ^{hydrogelsystem17,42}. Desuden kan vores metode på baggrund af vores tidligere arbejde være velegnet til IMP, der kan bære kortvarig eksponering for 30-40 °C. Kort, vi sprede en tynd film af agarose kombineret med membran fragmenter, der indeholder GPCR af interesse. Efter gelering af dette lag deponerer vi en lipidopløsning oven på agarose og tillader opløsningsmidlet at fordampe. Rehydrering af systemet blev derefter udført med en vandig buffer, hvilket resulterede i dannelsen af GUVs med protein indarbejdet i lipid bilayer.

Protocol

1. Proteinmærkning Tillad NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin afsaltningskolonne at ekvilibrere ved stuetemperatur. 1 mg NHS-rhodamin opløses i 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO). Der tilsættes 5 μL 1 M natriumbicarbonatopløsning for at øge pH-5-HT1AR-opløsningen til pH 8. Der tilsættes 3,66 μL af NHS-rhodaminopløsningen til 50 μL af 5-HT1AR-opløsningen og pipetten forsigtigt op og ned i et mikrocentrifugerør.BE…

Representative Results

Koncentrationen af protein blev målt, og mærkningsgraden blev beregnet som molarforholdet mellem farvestoffet og proteinet til 1:1. Ved at undersøge GUV’erne ved hjælp af konfokal mikroskopi var vi i stand til at bekræfte vellykket dannelse og proteinintegration af vesiklerne. Lipiderne blev mærket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet blev kovalent mærket via rhodamin NHS-ester modifikation af primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininst…

Discussion

Vi har identificeret to trin, der er afgørende for succesen af den samlede protokol: plasmabehandling og lipidaflejring. Plasmarensning udretter to ting: For det første fjerner det spor af organisk materiale fra glasoverfladen; For det andet aktiverer den coverlip-overfladen, hvilket giver mulighed for en stigning i vådbarheden, da glasoverfladen hydrofilitet ^øges62,63. Berøring af dækslet overflade efter plasmarensning vil inaktivere og forurene den ultrar…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882