Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

Summary

Ce protocole utilise le gonflement de l’agarose comme une technique puissante et généralisable pour incorporer des protéines membranaires intégrales (PIM) dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV), comme décrit ici pour la reconstitution de la protéine réceptrice de la sérotonine 1A humaine (_5-HT1AR), l’une des classes de récepteurs couplés à la protéine G pharmacologiquement importants.

Abstract

Des recherches in vitro robustes sur la structure et la fonction des protéines membranaires intégrales ont été un défi en raison de la complexité de la membrane plasmique et des nombreux facteurs qui influencent le comportement des protéines dans les cellules vivantes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont un système de modèle in vitro biomimétique et hautement accordable pour étudier les interactions protéine-membrane et sonder le comportement des protéines d’une manière précise et dépendante du stimulus. Dans ce protocole, nous présentons une méthode peu coûteuse et efficace pour fabriquer des GUV avec le récepteur humain de la sérotonine 1A (_5-HT1AR) intégré de manière stable dans la membrane. Nous fabriquons des GUV en utilisant une méthode de gonflement d’hydrogel modifiée; en déposant un film lipidique sur un mélange d’agarose et de _5-HT1AR puis en hydratant l’ensemble du système, des vésicules peuvent être formées avec du _5-HT1AR correctement orienté et fonctionnel incorporé dans la membrane. Ces GUV peuvent ensuite être utilisés pour examiner les interactions protéine-membrane et le comportement de localisation par microscopie. En fin de compte, ce protocole peut faire progresser notre compréhension de la fonctionnalité des protéines membranaires intégrales, fournissant un aperçu physiologique profond.

Introduction

Les membranes modèles synthétiques sont des outils puissants dans l’étude des propriétés et des fonctions fondamentales des biomembranes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont l’une des plates-formes les plus importantes pour étudier une variété de propriétés de la membrane plasmique et peuvent être conçues pour imiter différentes conditions physiologiques1,2,3,4,5,6,7,8. Il est bien établi que la membrane plasmique et son organisation jouent un rôle clé dans une multitude de processus cellulaires, tels que la transduction du signal, l’adhésion, l’endocytose et le transport9,10,11,12,13,14,15.

Les GUV ont été fabriqués à l’aide de diverses méthodes, notamment l’hydratation ^douce16, le gonflement de l’hydrogel17, ^{l’électroformation18}, les techniques microfluidiques19,20,21,22, le ^jet23 et l’échange ^{de solvant24,25,26}. En raison des difficultés rencontrées dans la manipulation des protéines membranaires intégrales (PIM), les plateformes in vitro pour les étudier ont été limitées. Les GUV présentent une plate-forme simplifiée pour étudier les PIM dans un environnement qui imite leur environnement natif. Bien qu’il y ait eu plusieurs approches pour la reconstitution des protéines dans les GUV, l’incorporation de protéines avec l’orientation correcte et le maintien de la fonctionnalité des ^protéines27 posent des défis.

La reconstitution protéique la plus réussie dans les GUV nécessite la méthode d’échange de détergent; qui consiste à solubiliser les protéines de leur environnement natif par des détergents, puis à les purifier, puis à remplacer les molécules de détergent par des lipides par diverses ^méthodes28. Alors que les détergents servent à stabiliser la structure tertiaire des PIM lors de la purification, les micelles de détergent sont un environnement relativement peu naturel pour ces protéines, qui sont mieux stabilisées, en particulier pour les études fonctionnelles, dans les bicouches lipidiques28,29,30. De plus, l’incorporation de protéines transmembranaires fonctionnelles dans la bicouche lipidique à l’aide des techniques traditionnelles de fabrication guV a été difficile en raison de la taille, de la délicatesse de ces protéines et des étapes supplémentaires d’échange de détergent qui seraient nécessaires27,31,32,33. L’utilisation de solvant organique pour éliminer les détergents provoque l’agrégation et la dénaturation des ^protéines34. Une méthode améliorée médiée par un détergent a été prometteuse, mais la prudence est nécessaire pour l’étape d’élimination du détergent et une optimisation pourrait être nécessaire pour des protéines ^{spécifiques31,35}. De plus, les méthodes qui utilisent l’électroformation pourraient restreindre le choix des protéines et peuvent ne pas convenir à toutes les compositions lipidiques, en particulier les lipides chargés31,36,37. Une autre technique qui a été utilisée est la fusion induite par les peptides de grandes vésicules unilamellaires (LUV) contenant la protéine souhaitée avec des GUV, bien qu’elle se soit avérée laborieuse et puisse conduire à l’insertion de molécules étrangères – les peptides fusogéniques33,38,39. Les vésicules géantes de la membrane plasmique (GPMV), qui sont dérivées de cellules vivantes, peuvent être utilisées pour surmonter certains de ces problèmes, mais elles permettent un contrôle minimal de la composition lipidique et protéique résultante14,40,41. Par conséquent, l’intégration des PIM dans la couche bilipidique des GUV à l’aide de notre méthode de gonflement de l’agarose modifiée présente une méthode fiable pour examiner plus en détail ces protéines dans ^{l’environnement} membranaire42,43,44,45.

La signalisation et la communication cellulaires impliquent une famille de protéines connues sous le nom de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG); Les RCPG font partie de la plus grande famille de protéines et sont associés à la modulation de l’humeur, de l’appétit, de la pression artérielle, de la fonction cardiovasculaire, de la respiration et du sommeil parmi de nombreuses autres fonctions ^{physiologiques46}. Dans cette étude, nous avons utilisé le récepteur humain de la sérotonine 1A (_5-HT1AR) qui est un membre prototypique de la famille gpCR. _5-HT1AR peut être trouvé dans le système nerveux central (SNC) et les vaisseaux sanguins; il influence de nombreuses fonctions telles que les fonctions cardiovasculaires, gastro-intestinales, endocriniennes, ainsi que la participation à la régulation de ^l’humeur47. Un obstacle important à la recherche sur les RCPG découle de leur structure amphiphile complexe, et les GUV représentent une plate-forme prometteuse pour l’étude de diverses propriétés d’intérêt, allant de la fonctionnalité des protéines, des interactions lipides-protéines et des interactions protéine-protéine. Diverses approches ont été utilisées pour étudier les interactions lipides-protéines telles que la résonance plasmonique de surface (SPR)^48,49, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)^50,51, le test de superposition de protéines lipidiques (PLO)^51,52,53,54, la spectrométrie de masse ^native55, la calorimétrie de titrage isotherme (ITC)^56,57 et le liposome essai de ^{sédimentation58,59}. Notre laboratoire a utilisé l’approche GUV simplifiée pour étudier l’effet des interactions lipides-protéines sur la fonctionnalité des protéines en incapsulant BODIPY-GTPγS, qui se lie à la sous-unité _Giα à l’état actif du récepteur. Leur liaison désenclenche le fluorophore produisant un signal de fluorescence qui pourrait être détecté au fil du ^temps45. De plus, diverses études ont étudié les interactions lipides-protéines et le rôle des protéines dans la détection ou la stabilisation de la courbure de la ^{membrane60,61}, et l’utilisation d’une approche GUV réalisable pourrait être un avantage clé.

Ce protocole démontre une méthode simple pour incorporer des RCPG dans la membrane des GUV à l’aide d’un système d’hydrogel d’agarose ^{modifié17,42}. De plus, sur la base de nos travaux antérieurs, notre méthode pourrait convenir aux PIM qui peuvent supporter une exposition à court terme à 30-40 ° C. En bref, nous étalons un mince film d’agarose combiné à des fragments de membrane contenant le RCPG d’intérêt. Suite à la gélification de cette couche, nous déposons une solution lipidique sur l’agarose et permettons au solvant de s’évaporer. La réhydratation du système a ensuite été réalisée avec un tampon aqueux, entraînant la formation de GUV avec des protéines incorporées dans la bicouche lipidique.

Protocol

1. Marquage des protéines Laissez le NHS-Rhodamine, les fragments de membrane 5-HT1A et une colonne de dessalement de spin de 7 K MWCO s’équilibrer à température ambiante. Dissoudre 1 mg de NHS-rhodamine dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ajouter 5 μL de solution de bicarbonate de sodium 1 M pour augmenter le pH de la solution 5-HT1AR à pH 8. Ajouter 3,66 μL de la solution de NHS-rhodamine à 50 μL de la solution 5-HT1AR et pipeter…

Representative Results

La concentration de protéines a été mesurée et le degré de marquage a été calculé comme le rapport molaire entre le colorant et la protéine étant de 1:1. En examinant les GUV à l’aide de la microscopie confocale, nous avons pu confirmer la formation réussie et l’intégration protéique des vésicules. Les lipides ont été marqués avec 0,4 mol% d’ATTO 488-DPPE, et la protéine a été marquée de manière covalente via la modification de l’ester NHS de rhodamine des amines primaires. <strong class="x…

Discussion

Nous avons identifié deux étapes essentielles au succès du protocole global: le traitement au plasma et le dépôt de lipides. Le nettoyage au plasma des couvercles est essentiel pour assurer une couverture et une adhérence adéquates de l’hydrogel d’agarose sur le couvercle en verre. Le nettoyage au plasma accomplit deux choses: premièrement, il élimine les traces de matière organique de la surface du verre; deuxièmement, il active la surface du couvercle, ce qui permet une augmentation de la mouillabilité …

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882