라오델파엑스 스트리아텔루스 타액 컬렉션을 위한 2층 멤브레인 샌드위치 방법
Summary
본 프로토콜은 인공 매체를 사용하여 피어싱 빨아 먹는 곤충으로부터 충분한 타액을 수집하는 방법을 설명합니다. 이것은 곤충 타액을 수집하고 곤충 먹이 기법과 벡터 매개 바이러스 전송에 타액 기능을 연구하기위한 편리한 방법입니다.
Abstract
동아시아에서 농업의 상당한 경제적 손실을 일으키는 쌀 줄무늬 바이러스 (RSV),는 전적으로 숙주 쌀 사이에서 효과적인 전송을위한 곤충 벡터에 의존한다. Laodelphax striatellus (작은 갈색 식물호퍼, SBPH)는 phloem에서 수액을 빨아들이면서 RSV를 수평으로 전송하는 1 차 곤충 벡터입니다. 타액은 곤충의 먹이 행동에 중요한 역할을합니다. 피어싱-빠는 먹이 기법으로 곤충의 타액에 대한 연구에 유용한 편리한 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법에서 곤충은 두 개의 뻗은 파라핀 필름 층 사이에 끼어있는 인공 식단을 먹을 수있었습니다. 타액을 함유한 식단은 매일 수집, 여과, 농축등을 통해 추가 분석을 위해 집중되었다. 마지막으로, 수집된 타액의 질은 단백질 염색 및 면역 블로팅에 의해 검사되었다. 이 방법은 SBPH의 타액에서 RSV 와 무신 과 같은 단백질의 존재를 검출함으로써 예시되었다. 이러한 인공 공급 및 타액 수집 방법은 먹이 행동과 바이러스 전송과 관련된 곤충 타액의 요인에 대한 추가 연구를위한 기초를 마련할 것입니다.
Introduction
테누이바이러스속의 네거티브 좌초 RNA 바이러스인 쌀줄무늬 바이러스(RSV)는 동아시아1,2,3에서쌀 생산에 심각한 질병을 일으킨다. 감염된 쌀 식물에서 건강한 식물로 RSV를 전송하는 것은 곤충 벡터에 따라 달라집니다, 주로 라오델파엑스 스트트리아텔루스, 이는 지속적인 전파 방식으로 RSV를 전송. SBPH는 RSV 감염 식물에 먹이 후 바이러스를 취득. 곤충 내부에 들어가면 RSV는 먹이기 하루 후 미드구트 상피 세포를 감염시키고 중간 구트 장벽을 통과하여 혈류를 관통합니다. 그 후, RSV는 혈몰리프를 통해 다른 조직으로 퍼지고 전파합니다. 약 10-14일 후의 잠정 기간 후, 침샘 내부의 바이러스는 분비타액을 통해 건강한 숙주 식물로 전염될 수 있으며, SBPH는 플록4,5,6,7,8,9,10에서 수액을 빨아들이는 동안 . 효율적인 공급 과정과 타액의 다양한 요인은 곤충에서 숙주 식물로 RSV의 확산에 필수적입니다.
타액선으로 분비되는 곤충 타액은 곤충, 바이러스 및 숙주 식물을 중재하는 것으로 추정됩니다. Hemipteran 곤충은 일반적으로 타액의 두 가지 유형을 생산 : 타액겔링 과 물 타액11,12,13. 겔링 타액은 주로 숙주 세포 들 사이에서 스타일운동의 움직임을 유지하기 위해 아포플라즘으로 분비되며 식물 성 저항및 면역반응(14,15,16,17)을극복하는 데도 관련이 있다. 먹이기의 탐사 단계에서 곤충은 간헐적으로 겔화 타액을 분비하여 즉시 산화되어 표면 플랜지를 형성합니다. 그런 다음 단일 또는 분기 된 칼집은스타일채널(18,19,20)을예약하도록 스타일이 감싸고 있다. 표피의 표면 플랜지는 앵커 포인트역할을 하여 스타일화의 침투를 용이하게 하는 것으로 추정되며, 스타일주위의 칼집은 기계적 안정성과윤활(16,21,22,23)을제공할 수 있다. Nlshp는 타액 칼집 형성과 갈색 식물호퍼(닐라파르바타 루겐스,BPH)의 성공적인 공급에 대한 필수 단백질로 확인되었다. 진딧물 아시르토시폰 피섬에 의해 분비되는 구조적 칼집 단백질(SHP)의 발현억제는 숙주체튜브(24)로부터의수유를 방해함으로써 번식을 감소시켰다. 더욱이, 몇몇 곤충 종에서는, 젤 타액 요인은 소위 초식동물 관련 분자 패턴 (HAMPs)를 형성해서 식물 면역 반응을 촉발하기 위하여 가정됩니다. N. lugens에서,NlMLP, 칼집 형성과 관련된 mucin 같은 단백질은 세포 사멸, 방위 관련 유전자의 발현 및 칼로스 증착(25,26)을포함하여 공급에 대한 식물 방어를 유도한다. 또한, 진딧물에서 일부 젤 타액 인자는 병원체-관련 분자 패턴12,15,27과유사한 유전자 대 유전자 상호 작용을 통해 식물 방어 반응을 유발하는 것으로 입증되었다.
곤충 수유 및/또는 병원균 전달에 필수적인 타액 인자를 연구하기 위해서는 분비타를 분석할 필요가 있습니다. 여기서, 충분한 양의 타액을 얻기 위한 인공 공급 및 수집 방법은 추가 분석을 위해 설명된다. 단 하나의 영양 원소만 을 함유한 배지를 사용하여, 많은 타액 단백질은 은 염색및 서양 얼룩에 의해 수집되고 분석되었다. 이 방법은 SBPH에 의한 RSV 전송에 필수적인 타액의 요인에 대한 추가 연구에 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인공 식단에 곤충의 성공적인 양육은 1962년에 미틀러와 Dadd가 인공 식단29,30을보유하기 위해 파라핀 막 기술을 설명했을 때 처음 보고되었습니다. 그리고이 방법은 곤충 생물학 및 행동의 많은 측면에서 탐구 되었습니다., 예를 들어, 영양소 보충, dsRNA 공급, 그리고 바이러스 수집. 타액 분석의 요구 사항에 따라, 5% 자당은 이 연구에서 SBPH의 타액을 수집…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립과학재단(2019YFC1200503호)과 청소년혁신진흥협회 32072385(2021084)가 지원했다.
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
Referências
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