Het huidige protocol beschrijft een methode om voldoende speeksel van priemzuigende insecten te verzamelen met behulp van een kunstmatig medium. Dit is een handige methode voor het verzamelen van insectenspeeksel en het bestuderen van speekselfunctie op insectenvoedingsgedrag en vectoroverdraagbare virusoverdracht.
Rijststreepvirus (RSV), dat een aanzienlijk economisch verlies van landbouw in Oost-Azië veroorzaakt, is volledig afhankelijk van insectenvectoren voor zijn effectieve overdracht onder gastheerrijst. Laodelphax striatellus (kleine bruine planthopper, SBPH) is de primaire insectenvector die RSV horizontaal doorgeeft terwijl sap uit het floëem wordt gezogen. Speeksel speelt een belangrijke rol in het voedingsgedrag van insecten. Een handige methode die nuttig zal zijn voor onderzoek naar het speeksel van insecten met piercing-zuigend voedingsgedrag wordt hier beschreven. Bij deze methode mochten insecten zich voeden met een kunstmatig dieet ingeklemd tussen twee uitgerekte paraffinefilmlagen. Het dieet met het speeksel werd elke dag verzameld, gefilterd en geconcentreerd voor verdere analyse. Ten slotte werd de kwaliteit van het verzamelde speeksel onderzocht door eiwitkleuring en immunoblotting. Deze methode werd geïllustreerd door de aanwezigheid van RSV en een mucine-achtig eiwit in het speeksel van SBPH te detecteren. Deze kunstmatige voedings- en speekselverzamelingsmethode zal een basis leggen voor verder onderzoek naar factoren in insectenspeeksel gerelateerd aan voedingsgedrag en virusoverdracht.
Rijststreepvirus (RSV), een negatief gestrand RNA-virus in het geslacht Tenuivirus, veroorzaakt ernstige ziekten in de rijstproductie in Oost-Azië1,2,3. Overdracht van RSV van geïnfecteerde rijstplanten naar gezonde is afhankelijk van insectenvectoren, voornamelijk Laodelphax striatellus, die RSV op een persistent-propagatieve manier overbrengt. SBPH verwerft het virus na het voeden met RSV-geïnfecteerde planten. Eenmaal in het insect infecteert RSV de midgut-epitheelcel een dag na het voeden en gaat vervolgens door de midgutbarrière om de hemolymfe te penetreren. Vervolgens verspreidt RSV zich via de hemolymfe in verschillende weefsels en plant zich vervolgens voort. Na een latente periode van ongeveer 10-14 dagen na de verwerving kan het virus in de speekselklier via het uitgescheiden speeksel worden overgedragen op de gezonde waardplanten, terwijl SBPH sap uit het floëemzuigt 4,5,6,7,8,9,10 . Een efficiënt voedingsproces en verschillende factoren in het speeksel zijn essentieel voor de verspreiding van RSV van het insect naar de waardplant.
Insectenspeeksel dat wordt uitgescheiden door speekselklieren wordt verondersteld insecten, virussen en waardplanten te bemiddelen. Hemipteran insecten produceren meestal twee soorten speeksel: geleer speeksel en waterig speeksel11,12,13. Geleerspeeksel wordt voornamelijk uitgescheiden in het apoplasma om de beweging van de stylet tussen gastheercellen te ondersteunen en is ook gerelateerd aan het overwinnen van plantresistentie en immuunresponsen14,15,16,17. In het tasterige stadium van het voeden scheiden insecten met tussenpozen geleerspeeksel af dat onmiddellijk wordt geoxideerd om een oppervlakteflens te vormen. Vervolgens omhullen enkele of vertakte omhulsels de stylet om een buisvormig kanaal18,19,20te reserveren. De oppervlakteflens op de opperhuid wordt verondersteld de penetratie van de stylet te vergemakkelijken door als ankerpunt te dienen, terwijl de mantels rond de stylet mechanische stabiliteit en smering kunnen bieden16,21,22,23. Nlshp werd geïdentificeerd als een essentieel eiwit voor speekselschedevorming en succesvolle voeding van bruine planthopper(Nilaparvata lugens, BPH). Remming van de expressie van het structurele schede-eiwit (SHP) dat wordt uitgescheiden door de bladluis Acyrthosiphon pisum verminderde de reproductie door het voeden van gastheerzeefbuizen te verstoren24. Bovendien wordt bij sommige insectensoorten verondersteld dat gelspeekselfactoren immuunresponsen van planten veroorzaken door zogenaamde herbivore-geassocieerde moleculaire patronen (HAMPs) te vormen. In N. lugensinduceert NlMLP, een mucine-achtig eiwit gerelateerd aan schedevorming, de afweer van planten tegen voeding, waaronder celdood, de expressie van verdedigingsgerelateerde genen en callose-afzetting 25,26. Ook is bewezen dat sommige gelspeekselfactoren bij bladluizen afweerreacties van planten veroorzaken via gen-naar-gen interacties vergelijkbaar met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen12,15,27.
Voor het bestuderen van de speekselfactoren die essentieel zijn voor insectenvoeding en / of pathogene overdracht, is het noodzakelijk om uitgescheiden speeksel te analyseren. Hier worden kunstmatige voedings- en verzamelmethoden beschreven om voldoende hoeveelheden speeksel te verkrijgen voor verdere analyse. Met behulp van een medium dat slechts één voedingselement bevatte, werden veel speekseleiwitten verzameld en geanalyseerd door zilverkleuring en western blotting. Deze methode zal nuttig zijn bij verder onderzoek naar factoren in speeksel die essentieel zijn voor RSV-overdracht door SBPH.
Succesvolle kweek van insecten op kunstmatige diëten werd voor het eerst gemeld in 1962 toen Mittler en Dadd de Paraffine-membraantechniek beschreven om een kunstmatig dieet te houden29,30. En deze methode is onderzocht in vele aspecten van insectenbiologie en -gedrag, bijvoorbeeld voedingssupplement, dsRNA-voeding en virusacquisitie. Op basis van de vereisten van speekselanalyse wordt 5% sucrose gebruikt als het algemene kunstmatige dieet om speeksel van SBPH i…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (nr. 2019YFC1200503), door de National Science Foundation of China (nr. 32072385) en door Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |