ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法
Summary
本プロトコルは、人工培地を用いて穿刺吸引昆虫から十分な唾液を採取する方法を説明する。昆虫の唾液を採取し、昆虫の摂食行動やベクター媒介ウイルス感染に関する唾液機能を研究する便利な方法です。
Abstract
東アジアの農業の著しい経済的損失を引き起こす米の縞(RSV)は、宿主米間の効果的な伝染のために昆虫ベクターに完全に依存している。 ラオデルファックスストリアテルス (小さな茶色の植物ホッパー、SBPH)は、フロエムから樹液を吸い込みながらRSVを水平に伝達する主要な昆虫ベクターです。唾液は昆虫の摂食行動に重要な役割を果たしている。ここでは、ピアス吸引の摂食行動を用いた昆虫の唾液の研究に役立つ便利な方法を説明します。この方法では、昆虫を2つの伸伸されたパラフィンフィルム層の間に挟まれた人工食を食べさせた。唾液を含む食事を毎日採取し、濾過し、さらに分析するために濃縮した。最後に、採取した唾液の質をタンパク質染色および免疫ブロット法で調べた。この方法は、SBPHの唾液中にRSVおよびムチン様タンパク質の存在を検出することによって例示した。これらの人工給餌および唾液採取法は、摂食行動およびウイルス感染に関連する昆虫唾液の要因に関するさらなる研究のための基礎となる。
Introduction
テヌイウイルス属のネガ鎖RNAウイルスである米縞ウイルス(RSV)は、東アジア1、2、3における米生産において重篤な疾患を引き起こす。感染した稲植物から健康な稲植物へのRSVの伝染は、RSVを持続的に伝播させるラオデルファックスストリアテルスを中心に昆虫ベクターに依存する。SBPHは、RSV感染した植物に餌を与えた後、ウイルスを取得します。昆虫の中に入ると、RSVは摂食の翌日に中腸上皮細胞に感染し、中間腸の障壁を通過してヘモリンフを貫通する。その後、RSVは、ヘモリンパを介して異なる組織に広がり、その後伝播する。取得後約10〜14日の潜伏期間の後、唾液腺内のウイルスは分泌唾液を介して健康な宿主植物に伝染し、SBPHはフロエム4、5、6、7、8、9、10から樹液を吸い込む.効率的な供給プロセスと唾液の様々な要因は、昆虫から宿主植物へのRSVの普及に不可欠です。
唾液腺から分泌される昆虫唾液は、昆虫、ウイルス、宿主植物を媒介すると考えられている。片虫虫は通常、唾液の2つのタイプを生成する:唾液と水性唾液11、12、13をゲル化する。ゲル化唾液は主に、宿主細胞間のスタイの動きを維持するためにアポプラズムに分泌され、また、植物抵抗性および免疫応答14、15、16、17を克服することに関連している。摂食の調査段階では、昆虫は断続的にゲル化唾液を分泌し、すぐに酸化されて表面フランジを形成する。次に、単一または分岐したシースは、管状チャネル18、19、20を予約するためにスキャレットを包み込む。表皮上の表面フランジは、アンカーポイントとして機能することによりスタイレットの浸透を促進すると推測され、一方、スタイレットの周囲の鞘は、機械的安定性および潤滑16、21、22、23を提供し得る。Nlshpは、唾液鞘形成および褐色植物ホッパーの供給に成功した(ニラパルバタルゲン、BPH)に必須のタンパク質として同定された。アブラムシアシルトシフォンピスムによって分泌される構造シースタンパク質(SHP)の発現の阻害は、宿主篩管24からの送出を妨害することによってその繁殖を減少させた。さらに、一部の昆虫種では、ゲル唾液因子は、いわゆる草食動物関連分子パターン(HAMPs)を形成することによって植物の免疫応答を引き起こすと考えられている。N.ルゲンでは、外装形成に関連するムチン様タンパク質であるNlMLPは、細胞死、防御関連遺伝子の発現、およびカロロース沈着25,26を含む摂食に対する植物防御を誘導する。また、アブラムシのゲル唾液因子の一部は、病原体関連分子パターン12、15、27と同様の遺伝子間相互作用を介して植物防御応答を引き起こすことが証明されている。
昆虫の餌や病原体の伝染に不可欠な唾液因子を研究するためには、分泌された唾液を分析する必要があります。ここで、十分な量の唾液を得るための人工給餌および採取方法が、さらなる分析のために説明される。単一の栄養元素のみを含む培地を用いて、多くの唾液タンパク質を採取し、銀染色およびウェスタンブロッティングによって分析した。この方法は、SBPHによるRSV伝達に不可欠な唾液の因子に関するさらなる研究に役立ちます.
Protocol
1. SBPH メンテナンス 実験室でガラス室あたりの5-6米(オリザサティバ cv.日本ベア)の苗を持つガラスインキュベーター(65 x 200ミリメートル)で、ビールフェロスとRSVフリーのSBPH個体を飼育します。16時間光/8時間暗光周期で25°Cで稲を育てます。注:ウイルスとRSVフリーのSBPHの個人は、当初、中国の江蘇省で捕まえられました。 SBPHのRSVを、RSVリボヌクレオタンパク質(RnPs)?…
Representative Results
人工給餌設備と唾液採取の概略図図1A は、唾液を回収するための給餌室として使用されるガラスシリンダー(15cm x 2.5cm)を示しています。まず、SBPH幼虫は、回収効率を向上させるために数時間飢えさせ、5分間冷却して固定化した。昆虫がガラスシリンダーに移された後、チャンバーの両方の開いた端部は伸びたパラフィン膜で覆われていた。一方の端で、…
Discussion
人工食餌上の昆虫の飼育に成功したのは、1962年にミットラーとダッドが人工食29,30を保持するパラフィン膜技術を説明した時に最初に報告された。そして、この方法は、昆虫の生物学や行動の多くの側面で探求されている,例えば栄養補助食品, dsRNAの摂食, ウイルス獲得.唾液分析の要件に基づいて、5%スクロースは、この研究でSBPHの唾液を収集する…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFC1200503)、中国国立科学財団(32072385第32072385)、青少年イノベーション促進協会CAS(2021084)によって支援されました。
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
Referências
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Citar este artigo
Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).