CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定
Summary
ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。
Abstract
外因性アポトーシスは、CD95/Fas/APO-1または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体1/受容体2(TRAIL-R1/R2)などの死受容体(DR)の活性化によって媒介される。これらの受容体を同一性リガンドで刺激すると、死を誘発するシグナル伝達複合体(DISC)の組み立てにつながる。DISCはDR、アダプタータンパク質Fas関連タンパク質と死ドメイン(FADD)、プロサスアーゼ-8/-10、および細胞FADD様インターロイキン(IL)-1β変換酵素阻害タンパク質(c-FLIP)を含む。DISCは、プロカスパス8の処理とアクティベーションのプラットフォームとして機能します。後者 は、DISC で組み立てられたデスエフェクタードメイン(DED)フィラメントにおける二量体化/オリゴマー化によって生じる。
procaspase-8 の活性化は、その処理が続いて、いくつかのステップで発生します。本研究では、この複合体におけるDISC形成およびプロアスパス8の処理を測定することを可能にする確立された実験ワークフローについて説明する。このワークフローは、ウェスタンブロット分析でサポートされている免疫沈降技術に基づいています。このワークフローは、DISCとその処理に対するprocaspase-8採用の異なるステップを注意深く監視することを可能にし、外因性アポトーシスの分子メカニズムを調査するために非常に関連性が高い。
Introduction
最もよく研究された死の受容体(DR)の1つはCD95(Fas、APO-1)である。外因性アポトーシス経路は、DRと同結合リガンドとの相互作用から始まり、CD95LはTRAIL-Rsに結合するCD95またはTRAILと相互作用する。この結果、対応するDR. DISC での DISC の形成は、CD95、 FADD、 プロカスラーゼ-8/-10、および c-FLIP タンパク質1,2からなる 。さらに、DISCは、CD95やFADDなどの死ドメイン(DD)含有タンパク質、およびFADD、プロカスパス-8/-10、およびc-FLIPなどのDED含有タンパク質との相互作用によって組み立てられる(図1)。Procaspase-8は、そのDEの関連付けを介してオリゴマー化を行い、その結果、DEDフィラメントの形成、続いてプロカスパス8の活性化および処理を行う。これは、カスパーゼカスケードをトリガーし、細胞死(図1)3、4につながる。従って、プロカスパス症−8は、CD95またはTRAIL−Rsによって媒介される外因性アポトーシス経路の中心イニシエーターカスパーゼであり、対応する高分子プラットフォームDISCで活性化される。
プロカスパスゼ-8の2つのアイソフォーム、すなわちプロカスパス-8a(p55)および-8b(p53)は、DISC5に採用することが知られている。両方のアイソフォームは、2つのDEを含む。DED1およびDED2は、触媒p18およびp10ドメインが続く、プロアスパス症-8a/bのN末端部分に位置する。プロアスパス症-8DEの詳細なクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)分析は、プロサスパス8タンパク質のDEDフィラメント4,6と呼ばれる糸状構造への組み立てを明らかにした。驚くべきことに、リニアプロアスパス8鎖は、最初は二量体化に従事し、続いてDISCでプロスパパス8活性化に従事することが示唆された。さて、これらの鎖は、プロカスパス-8DEDフィラメントの一部構造に過ぎず、後者は三重らせん3、4、6、7に組み立てられた3つの鎖を含むことが知られている。
DEDフィラメントでの二量体化の際、プロカスパス8a/bの立体構造変化は、プロアスパス-8の活性中心の形成と、その活性化3、8を導く。これに続いて、2つの経路を介して媒介されるprocaspase-8処理が続きます:最初のものはp43 / p41切断産物の生成を介して行き、2番目のものはp30切断産物の初期生成を介して行きます。p43/p41経路はAsp374でのプロスパパス-8a/bの切断によって開始され、p43/p41およびp12切断産物を生じる(図2)。また、これらの断片は、Asp384およびAsp210/216で自動触媒的に切断され、活性カスパーゼ-8ヘテロトラマーの形成を生じさせる、p10 2/p1829、10、11。また、p43/p41処理経路と並行して、プロカスパス-8a/bもAsp216で切断され、C末端切断生成物p30の形成につながり、続いてp10およびp1810に対するタンパク質分解が行われることが示された(図2)。
DEDフィラメントにおけるプロカスパス症-8a/b活性化はc-FLIP12というタンパク質によって厳密に調節される。c-FLIPタンパク質は、c-FLIPLong (c-FLIP L)、c-フリップショート(c-FLIPS)、c-FLIPラジ(c-FLIPR)の3つのアイソフォームで発生します。3 つのアイソフォームはいずれも、N 端子領域に 2 つの DE を含んでいます。c-FLIPLはまたC末端触媒的に不活性なカスパーゼ様ドメイン12、13を有する。c-FLIP-c-FLIPSとc-FLIPRの両方の短いアイソフォーム-DISC6、14、15でDEDフィラメント形成を妨害することによって抗アポトーシス的な方法で作用する。さらに、c-FLIPLは濃度依存的な方法でカスパーゼ-8の活性化を調節することができる。これは、プロと抗アポトーシス効果16、17、18の両方をもたらすことができます。触媒活性プロアスパスを形成することによって-8/c-FLIPLヘテロダイマー、c-FLIPLは、プロアスパス8の活性中心の安定化とその活性化をもたらす。c-FLIPLのプロまたは抗アポトーシス関数は、DEDフィラメントにおけるその量および後に組み立てられたプロスパパス症-8/c-FLIPLヘテロダイマー19の量に直接依存する。DISCでのC-FLIPLの低濃度または中間濃度は、カスパーゼ-8の活性化をサポートするDEDフィラメントで十分な量のプロスパパス酵素-8/c-FLIPLヘテロ二量体をもたらす。対照的に、c-FLIPLの増加量は、直接DISC20でその抗アポトーシス効果につながります。
まとめると、DISCでのprocaspase-8a/bの活性化と処理は、いくつかのステップを伴う高度に規制されたプロセスです。本論文では、DISCにおけるプロカスパス8処理の測定と、この複合体の組成の分析について議論する。これは、例示的なDR複合体としてCD95 DISCを使用して提示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このアプローチは、Kischkelら27 によって最初に記述され、それ以来いくつかのグループによって開発されました。この複合体における効率的なDISC-免疫沈降およびモニタリングカスパーゼ-8処理に関しては、いくつかの重要な問題を考慮する必要があります。
まず、免疫沈降の間に全ての洗浄工程に従う必要があります。特に重要なのは、セファロース?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ウィルヘルム・サンダー財団(2017.008.02)、EUプログラムERDF(欧州地域開発基金)、DFG(LA 2386)が資金を提供するダイナミックシステムセンター(CDS)が当社の活動を支援することを認めます。私たちの実験を支援してくれたカリーナ・グテクに感謝します。私たちは、私たちに原発性T細胞を提供したダーク・クラインホルド教授(OvGU、マクデブルク)を認めます。
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
Referências
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