Immunocoloration flottante libre du cerveau des souris
Summary
Ce protocole décrit une approche efficace et reproductible pour les études histologiques du cerveau de souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante, le montage tissulaire et l’imagerie.
Abstract
La coloration immunohistochimique du cerveau des souris est une technique de routine couramment utilisée en neurosciences pour étudier les mécanismes centraux sous-jacents à la régulation du métabolisme énergétique et d’autres processus neurobiologiques. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des résultats de l’histologie cérébrale peuvent varier d’un laboratoire à l’autre. Pour chaque expérience de coloration, il est nécessaire d’optimiser les procédures clés en fonction des différences d’espèces, de tissus, de protéines ciblées et des conditions de travail des réactifs. Cet article démontre un flux de travail fiable en détail, y compris la perfusion intra-aortique, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante librement, le montage tissulaire et l’imagerie, qui peuvent être facilement suivis par les chercheurs dans ce domaine.
Il est également question de la façon de modifier ces procédures pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Pour illustrer la fiabilité et l’efficacité de ce protocole, les filets périneuronaux ont été colorés avec de la glycine florbunda agglutinine (WFA) marquée à la biotine et de la vasopressine d’arginine (AVP) avec un anticorps anti-AVP dans le cerveau de la souris. Enfin, les détails critiques pour l’ensemble de la procédure ont été abordés, et les avantages de ce protocole par rapport à ceux d’autres protocoles. Pris ensemble, cet article présente un protocole optimisé pour l’immunocoloration flottante du tissu cérébral de souris. Le respect de ce protocole facilite ce processus pour les scientifiques débutants et supérieurs afin d’améliorer la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des études immunocolorantes.
Introduction
La prévalence de l’obésité et des comorbidités associées a atteint des niveaux épidémiques, ce qui a entraîné un énorme fardeau socioéconomique1,2. Divers modèles murins ont été développés pour mieux comprendre les processus biologiques responsables de l’obésité3,4. Parce que les mécanismes centraux sont importants pour la régulation de l’homéostasie énergétique dans ces modèles animaux, les études neuroanatomiques du cerveau des souris sont devenues une technique nécessaire dans ce domaine. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des techniques d’histologie cérébrale varient considérablement d’un laboratoire à l’autre et même d’un laboratoire à l’autre pour diverses raisons (p. ex., anticorps, tissus, traitements, espèces, objectifs de recherche). Par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole général pour les études histologiques du cerveau de la souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante librement, le montage tissulaire et l’imagerie. Pendant ce temps, les débutants peuvent rapidement apprendre, maîtriser et ajuster ce protocole pour satisfaire leurs besoins individuels.
La coloration immunohistochimique est une méthode établie qui a été largement utilisée pour visualiser des types cellulaires, des ARNm et des protéines spécifiques dans une variété de tissus (par exemple, le cerveau et les tissus périphériques)5,6. Plus précisément, un antigène d’intérêt peut être marqué par un anticorps primaire spécifique et un anticorps secondaire correspondant lié à une enzyme (p. ex. immunohistochimie chromogène) ou à un colorant fluorescent (isothiocyanate de fluorescéine)6. À titre d’exemple de l’utilité de ces techniques, β-endorphine [un peptide codé par la pro-opiomélanocortine (POMC)] et le c-fos (un marqueur de l’activité neuronale) ont été colorés dans le noyau arqué. Il a été démontré que la délétion de la tryptophane hydroxylase 2 (une enzyme faisant partie intégrante de la synthèse de la sérotonine) dans le noyau du raphé dorsal diminuait l’expression de c-fos dans les neurones POMC du noyau arqué7. De plus, la distribution de l’ARNm du récepteur de la vitamine D a été cartographiée dans le cerveau de la souris par hybridation in situ (ARN)8. Cet article présente une méthode fiable et efficace avec un flux de travail étape par étape pour l’immunocoloration flottante librement, visant à améliorer la qualité et la reproductibilité des études histologiques du cerveau de la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole fournit une méthode établie pour les études neuroanatomiques du cerveau de la souris, y compris la perfusion, la section des tissus, l’immunocoloration flottante libre, le montage tissulaire et l’imagerie. Cependant, quelques détails clés essentiels pour des résultats cohérents et fiables doivent être optimisés.
La qualité de la perfusion est essentielle pour une coloration réussie. Les résultats de la coloration peuvent être affectés si le sang reste dans le cer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les chercheurs ont été soutenus par des subventions des NIH (K01DK119471 à CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 et R01DK120858 à YX), USDA/CRIS (51000-064-01S à YX) et American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) à LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
Referências
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