Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo
Summary
Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.
Abstract
La colorazione immunoistochimica del cervello dei topi è una tecnica di routine comunemente usata nelle neuroscienze per studiare i meccanismi centrali alla base della regolazione del metabolismo energetico e di altri processi neurobiologici. Tuttavia, la qualità, l’affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell’istologia cerebrale possono variare tra i laboratori. Per ogni esperimento di colorazione, è necessario ottimizzare le procedure chiave in base alle differenze di specie, tessuti, proteine mirate e condizioni di lavoro dei reagenti. Questo documento dimostra un flusso di lavoro affidabile in dettaglio, tra cui perfusione intra-aortica, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging, che può essere seguito facilmente dai ricercatori in questo campo.
Sono inoltre discussi come modificare queste procedure per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Per illustrare l’affidabilità e l’efficienza di questo protocollo, le reti perineuronali sono state colorate con Listeria florbunda agglutinina (WFA) marcata con biotina e arginina vasopressina (AVP) con un anticorpo anti-AVP nel cervello del topo. Infine, sono stati affrontati i dettagli critici per l’intera procedura e i vantaggi di questo protocollo rispetto a quelli di altri protocolli. Nel complesso, questo documento presenta un protocollo ottimizzato per l’immunocolorazione fluttuante del tessuto cerebrale del topo. Seguire questo protocollo rende questo processo più facile sia per gli scienziati junior che senior per migliorare la qualità, l’affidabilità e la riproducibilità degli studi di immunocolorazione.
Introduction
La prevalenza dell’obesità e delle comorbidità associate ha raggiunto livelli epidemici, causando un enorme onere socioeconomico1,2. Sono stati sviluppati vari modelli murini per comprendere meglio i processi biologici responsabili dell’obesità3,4. Poiché i meccanismi centrali sono importanti per la regolazione dell’omeostasi energetica in questi modelli animali, gli studi neuroanatomici sul cervello dei topi sono diventati una tecnica necessaria in questo campo. Tuttavia, la qualità, l’affidabilità e la riproducibilità delle tecniche di istologia cerebrale variano considerevolmente tra i laboratori e persino i ricercatori all’interno dello stesso laboratorio per vari motivi (ad esempio, anticorpi, tessuti, trattamenti, specie, obiettivi di ricerca). Pertanto, è necessario stabilire un protocollo generale per gli studi istologici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Nel frattempo, i principianti possono imparare, padroneggiare e regolare rapidamente questo protocollo per soddisfare le loro esigenze individuali.
La colorazione immunoistochimica è un metodo consolidato che è stato ampiamente utilizzato per visualizzare specifici tipi di cellule, mRNA e proteine in una varietà di tessuti (ad esempio, cervello e tessuti periferici)5,6. Più specificamente, un antigene di interesse può essere etichettato da uno specifico anticorpo primario e da un corrispondente anticorpo secondario legato a un enzima (ad esempio, immunoistochimica cromogenica) o a un colorante fluorescente (isotiocianato di fluoresceina)6. Come esempio dell’utilità di queste tecniche, β-endorfina [un peptide codificato da pro-opiomelanocortina (POMC)] e c-fos (un marker di attività neuronale) sono stati colorati nel nucleo arcuato. La delezione della triptofano idrossilasi 2 (un enzima parte integrante della sintesi della serotonina) nel nucleo del rafe dorsale ha dimostrato di ridurre l’espressione di c-fos nei neuroni POMC nel nucleo arcuato7. Inoltre, la distribuzione dell’mRNA del recettore della vitamina D è stata mappata nel cervello del topo tramite ibridazione in situ (RNAscope)8. Questo documento presenta un metodo affidabile ed efficiente con un flusso di lavoro passo-passo per l’immunocolorazione fluttuante, con l’obiettivo di migliorare la qualità e la riproducibilità degli studi istologici del cervello del topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per studi neuroanatomici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento dei tessuti, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Tuttavia, alcuni dettagli chiave essenziali per risultati coerenti e affidabili devono essere ottimizzati.
La qualità della perfusione è fondamentale per una colorazione di successo. I risultati della colorazione potrebbero essere influenzati se il sangue rimane nel cervello, dato che le c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli investigatori sono stati supportati da sovvenzioni del NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 e R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) e American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
Referências
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