Summary
여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.
Abstract
초저온 전자 단층 촬영(Cryo-ET)은 원래의 냉동 수화 상태에서 세포 미세 구조 및 분자 복합체를 조사하기 위해 선택되는 방법이 되었습니다. 그러나 Cryo-ET는 입사 전자빔이 산란되거나 차단되지 않을 만큼 샘플이 얇아야 합니다. 두꺼운 세포 샘플의 경우 극저온 집속 이온 빔(FIB) 밀링을 통해 이를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 3D 상관 접근법을 사용하여 FIB 밀링 중에 특정 세포 부위를 표적으로 삼는 방법을 설명합니다.이 접근법은 3 차원 형광 현미경 데이터와 FIB 주사 전자 현미경의 정보를 결합합니다. 이 기술을 사용하면 희귀 세포 이벤트 및 구조를 높은 정확도로 표적화하고 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM)을 사용하여 분자 분해능으로 시각화할 수 있습니다.
Introduction
집속 이온빔 밀링을 사용하면 나이프 마크 및 압축 아티팩트와 같은 기계적 절단과 일반적으로 관련된 문제 없이 극저온 고정 시편에서 얇은 생물학적 샘플을 준비할 수 있습니다1. 초저온 전자 단층 촬영과 함께 사용하면 FIB 밀링은 세포 형태에 대한 고해상도 생물학적 연구와 나노 미터 미만의 분해능 2,3,4에서 세포 내에서 직접 거대 분자 복합체의 구조를 결정할 수 있습니다. 리보솜과 같은 풍부한 종은 무작위로 절단된 FIB 라멜라에서 쉽게 발견되지만 많은 세포 과정은 여러 복합체의 공동 국소화에 의존하거나 세포 내의 특정 부위에 국한됩니다. 결과적으로, 효율적인 타겟팅은 밀링 공정 동안 관심있는 생물학적 특징을 잃지 않고 무작위 타격으로 제한되지 않도록 요구된다. 따라서 주사 전자 현미경 (SEM) -FIB와 극저온 형광 광학 현미경 (FLM)의 데이터를 결합하는 상관 접근법이 필요합니다. TEM 획득5,6 후에만 초기 상관관계를 생략하고 FLM과 Cryo-ET 데이터를 결합할 수 있지만, 형광 유도 집속 이온빔 밀링을 사용하면 밀링 영역을 미리 정확하게 선택할 수 있으므로 보다 효율적인 데이터 수집이 가능합니다. 개념7 이후, 생물학적 연구에서 3D 상관 FIB 밀링의 적용은 최근에이 기술을 사용하여 효모에서 새로운 액체 - 액체 상 분리 (LLPS) 구획을 확인했다고보고 할 때까지 제한되었습니다8.
여기에 설명된 것은 박테리아에서 효모 및 포유류 세포에 이르는 다양한 샘플을 연구하는 데 사용할 수 있는 일반화된 3D 초저온 상관 광 및 전자 현미경(CLEM) 프로토콜입니다. 실험은 특정 세트의 기기를 사용하여 수행되었지만, 개별 단계는 특정 하드웨어에 구속되지 않으며 기존 프로토콜(3,5)에 대한 확장으로서 다른 시스템으로 쉽게 전송될 수 있습니다. 테스트된 장비 및 제안된 설정 목록은 재료 표와 표 1에 나와 있습니다. 파이프라인의 4가지 주요 단계는 (1) 시료 전처리, (2) 극저온 형광 현미경을 통한 관심 특징의 국소화, (3) 3D 상관 집속 이온빔 밀링, (4) 극저온 투과 전자 현미경의 라멜라에 대한 Cryo-ET 데이터 수집을 위한 표적 구조의 국소화입니다(그림 1).
Protocol
그림 1: 중요한 단계를 선택한 워크플로 요약Figure 1: Summary of the workflow with a selection of critical steps. 전체 프로토콜은 사용된 장비에 따라 플런지 동결, 극저온 형광 현미경, 극저온 집속 이온빔 밀링 및 초저온 전자 현미경을 포함한 시료 전처리의 4단계로 나뉩니다. 각 단계에서 몇 가지 핵심 사항이 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 세포 배양 및 그리드의 급락 동결
- 선택한 세포를 배양하고 극저온 실험으로 이동하기 전에 실온에서 라벨링 및 처리 전략을 최적화합니다. 관심 대상은 형광 단백질 융합 또는 라이브 염색(예: Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, 라이브 항체 염색 등)을 사용하여 라벨링됩니다. 관심 있는 생물학적 과정을 조사하기 위해 화학적 또는 생물학적 제제(소분자, 특수 배지, siRNA 등)를 사용한 처리가 필요한 경우 라이브 셀 FLM 이미징을 사용하여 조건(예: 시간, 농도)을 최적화합니다.
- 관심 부위가 이후 극저온 조건(예: NA, 노출 시간 등)과 최대한 일치하는 이미징 설정을 사용하여 충분한 수의 세포에서 배경 위에 성공적으로 국한될 수 있는지 확인합니다.
- 그리드 선택 및 준비
- 사용된 셀 및 기준 마커에 적합한 구멍 크기와 간격이 있는 그리드를 선택합니다(1.3.1단계 참조). 구멍이 없는 연속 필름은 블로팅 후 잔류 버퍼가 너무 많아 유리화 효율이 감소하고 기준 비드의 검출을 방해할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 세포와 그리드의 장기간 접촉을 위해, 그리드 지지대와 필름 재료가 생체 적합성인지 확인하십시오.
- Cryo-EM 그리드를 플라즈마 세척하여 친수성을 높입니다. 부착 세포 배양에 사용하려면 층류 후드에서 20분 동안 UV 방사선으로 플라즈마 세척 후 그리드를 멸균합니다. 임의로, 그리드는 세포 부착을 돕는 화합물, 예를 들어 폴리-L-라이신 또는 콘카나발린 A로 후술하는 바와 같이 전처리될 수 있다.
참고 : 일반적으로 다음과 같은 그리드 / 샘플 조합이 상관 cryo-FIB 워크 플로우에서 성공적으로 사용되었습니다 : 효모 : Cu 또는 Au, 200 메쉬, R1 / 4 탄소 또는 SiO2 필름, 선택적으로 concanavalin A로 코팅; 대장균 : Cu 또는 Au, 200 메쉬, R1 / 4 탄소 또는 SiO2 필름; 클라미도모나스 라인하르티: Cu 또는 Au, 200 메쉬, R1/2 또는 R1/4 탄소 또는SiO2 필름; HeLa: Au, 200 메쉬, R1/4SiO2 필름, 폴리-L-라이신으로 코팅됨; HEK293 : Au, 200 메쉬, R1 / 4 SiO2 필름, 폴리 -L- 라이신으로 코팅. - 효모 세포의 부착을 개선하기위한 Concanavalin A 코팅 :
- 100μMCaCl2, pH 8.5를 갖는 10mM HEPES 완충액에 콘카나발린 A 1mg/mL의 코팅 용액을 준비합니다. 코팅 용액 한 방울(50μL)과 증류수 두 방울을 파라핀 필름 조각에 별도로 놓습니다.
- 역력 핀셋으로 플라즈마 세척 그리드를 집어 들고 필름 손상을 방지하기 위해 그리드에 수직인 움직임을 피하면서 코팅 용액 한 방울에 조심스럽게 삽입합니다.
- ~5초 배양 후 그리드를 비슷한 방식으로 물방울에 삽입하여 두 번 세척합니다. 마지막으로 그리드 뒷면에 여과지를 바르고 그리드를 완전히 건조시킨 후 핀셋에서 분리하여 과도한 액체를 닦아냅니다. 급락 동결을 위해 건조 된 그리드를 사용하십시오.
- 현탁 배양 및 부착 세포를 위한 Poly-L-lysine 코팅:
- 0.1M 붕산나트륨 완충액, pH 8.5에 폴리-L-라이신 1mg/mL의 코팅 용액을 준비합니다.
- 혈장 세척 그리드를 세포 배양에 적합한 접시에 넣고 UV 방사선으로 20분 동안 멸균합니다.
- 모든 그리드를 덮을 수 있을 만큼 충분한 코팅 용액을 부드럽게 추가하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 액체를 흡인하고 세포를 원하는 농도로 파종하기 전에 PBS로 그리드를 두 번 부드럽게 세척합니다.
- 세포 및 기준 비드의 제조
참고 : 기준 비드는 3D 상관 FIB 밀링을 허용하기 위해 FIB / SEM 현미경으로 촬영 한 이미지와 형광 데이터의 3D 등록에 필요합니다.- FLM, SEM 및 IB(권장 직경 0.5-1μm)와 같은 모든 이미징 방식에서 인식할 수 있는 비드를 선택하되, 비드와 관심 있는 생물학적 특징을 더 쉽게 구별할 수 있도록 형광 이미징 중에 이러한 비드가 세포 표적 구조보다 더 빛나지 않도록 하십시오. 제조자에 의해 지시된 바에 따라 기준 비드(예를 들어,NaN3)에서 세포독성 보존제를 제거한다.
참고: 관심 있는 생물학적 특징과 기준점을 더 쉽게 구분하기 위해 형광 방출 스펙트럼이 부분적으로만 겹쳐서 FLM 채널의 강도 차이에 따라 신호를 구별할 수 있는 경우에 유용합니다. - 현탁 배양을 사용하는 경우 세포를 적절한 밀도(예: 효모 OD 600 = 0.8, 대장균 OD600 = 0.8-1.0, C. reinhardtii 1500 cells/μL)로 성장시키고 배지 변경, 화학 물질 첨가, 기아 등과 같은 실험에 필요한 처리를 수행합니다. 플런지 방법(수동/자동)에 따라 플라즈마 세척 그리드를 핀셋에 부착하고 ~1 x 105 beads/μL의 기준 비드 현탁액과 혼합된 세포 현탁액 4μL를 그리드의 필름 면에 적용합니다.
참고: 적정 실험에서 세포 및 기준액의 최적 희석을 결정합니다(예: cryo-FLM 또는 FIB/SEM 확인, 아래 참조). 그러나 현탁액에서 성장한 대부분의 세포에 대해 1μm 기준 비드의 최종 농도는 ~1 x 105 beads/μL(재고에서 1:20 희석, 자세한 내용은 재료 표 참조)가 좋은 출발점임이 입증되었습니다. - 부착 배양을 사용하는 경우 무균 배양을 위해 UV 방사선을 사용하여 그리드를 플라즈마 세척하고 멸균합니다. 필요한 경우 세포 부착을 돕는 화합물(예: 폴리-l-라이신, 피브로넥틴, 라미닌, 단계 1.2.2 참조)로 그리드를 미리 코팅합니다. 일반 배양 접시 또는 격자에 대한 세분화가 있는 접시의 그리드에 세포를 뿌리고 성장시킵니다.
- 실험에 필요한 샘플을 처리하고 급락 동결이 될 때까지 세포를 최적의 조건으로 유지합니다(예: HEK/HeLa의 경우 37°C/5% CO2 ). 배양 접시에서 그리드를 조심스럽게 제거하고 급락 핀셋에 부착하십시오. 기준점(1 x 105 beads /μL)과 혼합된 배양액 4 μL을 세포 베어링 측에 적용합니다.
- FLM, SEM 및 IB(권장 직경 0.5-1μm)와 같은 모든 이미징 방식에서 인식할 수 있는 비드를 선택하되, 비드와 관심 있는 생물학적 특징을 더 쉽게 구별할 수 있도록 형광 이미징 중에 이러한 비드가 세포 표적 구조보다 더 빛나지 않도록 하십시오. 제조자에 의해 지시된 바에 따라 기준 비드(예를 들어,NaN3)에서 세포독성 보존제를 제거한다.
- 수동 또는 자동 동결 절차를 사용하여 세포를 급락 동결합니다. 가능하면 셀이 기계적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 셀 반대쪽에서만 그리드를 블롯합니다(그림 2A). 두 팔 자동 플런지 시스템에서는 셀을 향한 패드에 압지 대신 폴리테트라플루오로에틸렌(예: 테프론) 시트를 놓으면 됩니다. 그리드를 보관 상자로 옮기고 사용할 때까지 액체 질소(lN2)에 보관하십시오.
주의 : ln2 및 기타 극저온 물질은 눈과 피부에 심각한 손상을 줄 수 있습니다. 개인 보호 장비(PPE)를 사용하고 위험한 N2 농도가 축적되지 않도록 환기가 잘 되는 공간에서만 작업하십시오.
참고: 모든 후속 단계는 다운스트림 처리를 복잡하게 할 수 있으므로 세포 및 라멜라 표면의 오염을 피하기 위해 lN2 의 액상에서 가장 잘 수행되어야 합니다. 항상 깨끗한 액체 질소(예: 떠다니는 얼음을 제거하는 필터)를 사용하고, 불필요한 이송 단계를 제거하고, 가능하면 습도가 조절되는 환경에서 작업하여 떠다니는 얼음 결정과의 접촉을 줄입니다. - 후속 극저온 형광 이미징 및 FIB 밀링을 위해 컷아웃과 셀이 위를 향하도록 AutoGrids에 플런지 동결 그리드를 장착하고 클립합니다(그림 2A). TEM에서 시료의 적절한 정렬을 보장하려면 밀링 방향이 Cryo-ET 틸트 축과 직교해야 합니다. 따라서 이 정렬에 도움이 되도록 클리핑하기 전에 AutoGrid에 방향 표시(예: LASER 조각 또는 제거 가능한 마커 점)를 배치합니다(그림 2A).
- cryo-FLM 및 FIB/SEM에서 그리드 품질(그림 2B)을 스크리닝합니다. 세포 밀도, 블로팅 시간 및 힘을 최적화하여 세포와 비드의 균일한 분포를 얻을 수 있습니다. 극저온 형광 현미경에서 반사광 이미징을 사용하거나 cryo-FIB-SEM을 사용하여 세포와 기준 비드가 모두 명확하게 보이는지 확인합니다(그림 2B, 흰색 화살표).
- 필요한 경우 더 나은 조건(예: 다양한 세포 농도 및/또는 블로팅 시간)으로 플런징을 반복합니다. 적절한 플런지 매개변수가 발견되면 새로운 실험 라운드마다 그리드 스크리닝을 반복하지 마십시오.
그림 2: SEM 및 IB를 사용한 적합한 그리드 스크리닝 . (A) 방향 표시는 TEM으로의 올바른 로딩을 단순화하기 위해 밀링 방향에 수직인 AutoGrid에 배치해야 합니다. 셀은 조립된 AutoGrid에서 위를 향하도록 장착됩니다. (B) 플런지 동결 후 SEM에서 그리드를 검사하여 플런지 조건을 평가하고 최적화합니다. a) 그리드당 셀이 너무 많아서는 안 됩니다. 예를 들어 HeLa 세포의 경우 1-4개 이상의 세포/정사각형을 사용하지 마십시오. 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae )와 같은 더 작은 세포의 경우(여기에 표시됨) 4-6개의 세포 덩어리가 유용한 것으로 밝혀졌습니다. b) 기준 구슬(흰색 화살표)이 명확하게 보여야 하며 세포 주위에 완충액이 너무 많아서는 안 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 극저온 형광 광학 현미경
- 각 그리드에 대해 (광시야) 형광 및 미분 간섭 대비(DIC) 또는 반사 모드에서 개요를 수집하고 형광 신호가 있는 적절한 그리드 사각형을 선택합니다. 관심 있는 셀과 충분한 수의 기준 마커를 모두 포함하는 시야를 선택합니다(6-12).
- 세포와 비드가 너무 조밀하지 않고 각 사각형의 중심을 향해 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오. FIB-SEM 및 TEM 기기 모두에 액세스 할 수있는 사각형 만 선택하므로 200 메쉬 그리드의 그리드 가장자리에서 최소 3 개의 사각형이 떨어져 있습니다 (그림 3A, 빨간색 원 내부).
- 선택된 각 그리드 사각형에서 추후 디콘볼루션에 적합한 초점 단계, 즉 축 분해능 한계의 <1/2인 형광 스택을 획득합니다. 가능하면 높은 개구수(NA) 대물렌즈를 사용하여 광자 수와 위치 정확도를 높입니다.
- NA 0.9 대물렌즈를 사용하는 컨포칼 현미경에서 300nm 스텝 크기의 스택을 획득하여 나이퀴스트 값을 오버샘플링합니다. 필요한 경우 여러 색상 스택을 기록합니다(그림 2B). 나중에 사용할 때까지 그리드를 lN2 아래에 보관하십시오.
참고: 최적의 스텝 크기를 결정하려면 현미경 제어 소프트웨어에서 계산한 값을 선택하거나 온라인 도구9를 사용하십시오. 과도한 블리드스루는 colocalization 실험에 해롭기 때문에 채널 간 신호의 블리드스루를 확인합니다. 그러나 일부는 다중 색상 스택에서 색수차를 수정하는 데 유리할 수 있습니다.
- NA 0.9 대물렌즈를 사용하는 컨포칼 현미경에서 300nm 스텝 크기의 스택을 획득하여 나이퀴스트 값을 오버샘플링합니다. 필요한 경우 여러 색상 스택을 기록합니다(그림 2B). 나중에 사용할 때까지 그리드를 lN2 아래에 보관하십시오.
- 적절한 소프트웨어10,11을 사용하여 스택을 디콘볼루브하고 등방성 픽셀 크기가 필요한 경우 다시 슬라이스합니다.7 디콘볼루션은 실온에서와 마찬가지로 FLM 신호를 정리하고 국위 파악 정확도를 향상시킬 수 있습니다(그림 3C).
그림 3: 디콘볼루션을 통한 FLM 스택 획득 및 데이터 개선을 위한 사각형 선택 . (A) eGFP-Ede1(녹색) 및 mCherry-Atg8(자홍색)을 발현하는 효모 세포로 급락한 그리드의 개요. 구슬과 세포가 잘 분포 된 위치를 선택하되 그리드의 가장자리 (빨간색 음영)는 피하십시오. 상자는 형광 스택을 채취한 세포 분포가 양호한 위치를 나타냅니다. (B) 디콘볼루션 후 노란색 상자 사각형(A에서)에서 촬영한 다중 색상 스택의 최대 강도 투영(MIP). FLM 스택의 디콘볼루션은 원치 않는 배경 신호를 크게 정리하고 디콘볼루션 전(C)과 후의 가우스 피팅(D)에서 알 수 있듯이 z의 비드를 보다 정확하게 현지화하는 데 도움이 됩니다(피팅은 3DCT에서 수행되었으며 1로 표시된 비드에 대해 표시됨). 이미지는 빨간색 채널의 확대된 MIP 보기를 보여줍니다(여기: 552nm, 방출: 585-650nm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 집중 이온빔 밀링
- 그리드를 cryo-FIB-SEM 기기에로드하고 컷 아웃 및 / 또는 방향 표시를 사용하여 나중에 TEM에 배치 할 수 있도록 적절한 방향을 보장합니다 (그림 2A). 밀링 방향이 TEM의 틸트 축에 수직인지 확인하십시오.
- 가스 분사 시스템(GIS; CpMePtMe3) FIB-SEM 설정에 의해 미리 정의된 스테이지 위치에서 그리드를 보호 유기 금속 층으로 코팅합니다. 나중에 TEM에서 기준 비드 국소화를 방해할 수 있으므로 너무 많이 적용하지 마십시오. 플라즈마 코팅기를 사용하여 금속 백금을 도포하여 시료 충전을 줄입니다.
참고 : GIS 코팅에 대한 설정을 사용할 수없는 경우 짧은 코팅 (~ 2 초)을 연속적으로 수행 한 다음 FIB 밀링을 수행하여 쉽게 찾을 수 있습니다. 라멜라 가장자리 주변의 보호 유기 금속 층의 명백한 프린지 없이 중전류(~100pA)에서 샘플을 성공적으로 절단할 수 있는지 확인하십시오. GIS 바늘의 시간과 거리(샘플과 관련하여)는 모두 고려해야 할 중요한 매개변수입니다. 실온 설정(즉, 45°C)에서 GIS 바늘을 작동하지 말고 균일한 코팅(25-27°C)을 제공하기 위해 가능한 한 차갑게 작동하십시오. - SEM 그리드 오버뷰를 기록하고 FLM 뷰와 2D 상관 관계를 수행하여 형광 스택이 기록된 그리드 사각형을 찾습니다. 두 뷰를 수동으로 검사하거나 다양한 소프트웨어 패키지 7,10,12를 사용하여 그리드 사각형을 찾습니다. 여기서는 뷰 간 등방성 스케일링과 함께 3D 강체 변환을 사용하는 3D 상관 관계 도구 상자(3DCT)7에 초점을 맞춥니다. 3DCT 기능에 대한 훌륭한 연습은 온라인에서 사용할 수 있습니다13.
- FLM 및 SEM 그리드 개요(오른쪽 클릭)에서 서포트 필름의 그리드 바 또는 구멍과 같은 랜드마크와 같은 최소 4개의 해당 위치를 선택하고 표시하고 표시된 지점 간의 변환을 계산합니다(상관 관계).
- 다음으로, FLM 스택이 획득된 해당 그리드 사각형의 중앙에 마커를 배치하고 SEM 보기에서 마커의 위치를 예측합니다(correlate; 그림 4A).
- 각 상관 그리드 사각형에 대해 선택한 FIB 밀링 각도 (10 ° 사전 틸트 셔틀의 경우 25 ° -45 °)에서 저전류 (≤ 10pA) 이온 빔 (IB) 이미지를 가져옵니다. 형광 데이터와 일치하는 시야(즉, 위치 및 배율)를 선택합니다. 200 메쉬 그리드의 경우 형광 및 FIB / SEM 데이터를 수집하여 그리드 막대를 포함한 단일 그리드 사각형을 포함합니다 (그림 3A 및 그림 4A 참조).
참고: Cryo-ET 동안 상당한 각도 범위를 잃지 않고 충분한 수의 기준 비드를 식별할 수 있도록 가능한 한 얕은 각도로 밀링을 수행해야 합니다. 예를 들어, 스테이지 틸트가 17°, 셔틀 프리틸트가 45°, FIB 빔 틸트가 52°인 경우, 라멜라 프리틸트는 10°이며, 이는 많은 TEM 극저온 홀더의 최대값인 -50°에서 +70°까지 기울임으로써 TEM에서 선호하는 각도 범위인 ±60°를 충족합니다. - 동일한 사각형의 SEM 이미지를 촬영하여 형광 및 이온 빔 보기에서 해당 비드를 식별하는 데 도움이 됩니다.
- 다음 (그림 4B) 단계에 설명된 대로 3DCT를 사용하여 각 위치에 대한 디콘볼루션된 3D FLM 스택 및 2D 이온 빔 뷰를 정합합니다.
- 해당 리슬라이싱된 3D FLM 스택 및 이온 빔(IB) 뷰를 3DCT에 로드합니다.
참고: 다색 형광 데이터는 최대 3개의 개별 단일 채널 스택 파일로 로드할 수 있습니다. - 형광 데이터에서 4개의 기준 비드를 선택하고 위치 목록을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 x, y, z 신호의 가우스 피팅을 통해 3D 위치를 결정합니다. IB 이미지에서 해당 비드를 선택하고 초기 3D 상관관계(상관관계)를 수행합니다.
- 형광 이미지에 더 많은 비드를 반복적으로 추가하고, 3D 위치를 구체화하고, IB 보기에서 위치를 예측하여 등록에 더 많은 비드를 빠르게 추가하고 상관 관계의 정확성을 확인할 수 있습니다. 3DCT에서는 상관관계의 일관성을 평가하기 위해 RMSE(root-mean-square error) 값이 제공된다7.
- RMSE 값이 작고 현지화 정확도(~300nm) 정도인지 확인합니다. 상관 관계의 정확성을 결정하려면 등록 단계에서 의도적으로 형광과 이온 빔 모두에서 명확하게 식별할 수 있는 일부 기준 비드를 생략합니다. 이온 빔 이미지에서 예측된 위치와 실제 위치를 확인하여 이를 수행합니다. 예측 위치가 실제 위치와 크게 다르면 새 기준점 집합으로 초기 상관 관계를 반복합니다.
참고: 6-8개의 비드를 상관시키는 것은 FLM 스택 및 IB 보기의 정확한 등록에 충분한 것으로 입증되었습니다. 그러나 광범위한 z 값에 대해 더 많은 기준점(최대 12-15)을 추가하면(예: 그리드 막대 또는 인접한 사각형에서 비드를 선택하여) 상관 관계의 정확도가 향상될 수 있습니다.
- RMSE 값이 작고 현지화 정확도(~300nm) 정도인지 확인합니다. 상관 관계의 정확성을 결정하려면 등록 단계에서 의도적으로 형광과 이온 빔 모두에서 명확하게 식별할 수 있는 일부 기준 비드를 생략합니다. 이온 빔 이미지에서 예측된 위치와 실제 위치를 확인하여 이를 수행합니다. 예측 위치가 실제 위치와 크게 다르면 새 기준점 집합으로 초기 상관 관계를 반복합니다.
- 표적 셀룰러 신호를 선택하고, FLM 스택에 3D 위치를 맞추고, 변환을 적용하여 IB 보기에서 표적 위치를 예측합니다(그림 4B).
참고: IB 목록에 해당 항목이 없는 FLM 위치 목록의 모든 항목은 예측할 신호로 처리됩니다.
- 해당 리슬라이싱된 3D FLM 스택 및 이온 빔(IB) 뷰를 3DCT에 로드합니다.
- 각 상관 정사각형에 대해 관심 있는 특징의 예측 위치를 FIB-SEM 기기로 전송하고 라멜라 밀링 패턴을 배치합니다(그림 4C). 수동으로 위치를 이동하거나 (예 : 세포 또는 기준 비드와 같은 가시적 인 랜드 마크까지의 거리를 측정하여) 예를 들어 SerialFIB14에서 구현 된대로 자동화 및 스크립팅을 사용합니다. 셀당 여러 신호가 있는 경우 처리량을 늘리기 위해 동일한 라멜라에 가능한 한 많은 관심 지점(POI)을 포함하도록 패턴을 배치합니다.
- 먼저 라멜라를 150-250 nm의 최종 두께로 거칠게 분쇄 한 다음 미세 분쇄합니다. 라멜라의 처짐을 유발하여 이전에 획득한 FLM 스택에 대한 실제 관심 피쳐의 이동을 초래하는 단계(예: 응력 제거 컷15)를 피하십시오. 수동3 또는 자동14,16,17,18 FIB 밀링 절차를 사용하십시오. 두 가지 방법 중 하나를 사용하면 위쪽과 아래쪽에서 대칭적으로 얇게 하여 관심 있는 특징이 라멜라의 중앙에 남아 있는지 확인합니다.
- 각 라멜라에 대한 밀링 정확도를 평가하려면 3.4단계에서와 동일한 등록을 수행합니다. 그러나 이번에는 FIB 밀링 후 최종 IB 이미지를 사용하여 관심있는 특징의 예측 된 위치가 최종 라멜라 내에 포함되어 있는지 확인하십시오. 또는 3DCT의 출력 및 사용자 정의 스크립트(19)에서 얻은 FLM 스택의 회전된 투영을 최종 IB 이미지와 오버레이합니다(그림 4C, 작은 삽입물).
그림 4 : 3D 상관 FIB 밀링 절차. (A) 그리드의 FLM (왼쪽)과 SEM (오른쪽) 개요의 2D-2D 상관 관계는 이전에 형광 스택을 찍은 그리드 사각형을 찾는 데 사용됩니다. (B) 선택된 각 사각형에 대해, 3DCT (컬러 박스)에서 해당 기준 위치의 3D-2D 등록 후, 관심있는 생물학적 특징의 위치가 FLM 데이터에서 선택된다. 이온 빔 이미지(빨간색 원)에서 해당 위치의 예측에 기초하여, 라멜라 준비를 위한 부위가 선택된다. (C) 주사 전자 현미경 (SEM) 및 이온 빔 (IB) 이미지는 밀링 중에 타겟을 중심에 유지하는 데 사용됩니다. 150-250 nm의 최종 두께는 추가 다운스트림 처리에 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 상관 TEM
- 그리드를 TEM에 로드하여 라멜라 방향(컷아웃 또는 방향 표시에서 알 수 있음)이 기울기 축에 수직인지 확인합니다.
참고: 다양한 제조업체의 현미경은 Tomo5, TOM 또는 SerialEM20과 같은 다양한 소프트웨어를 사용하여 제어할 수 있습니다. 여기서는 후자에 초점을 맞춥니다. - 격자 몽타주와 라멜라를 포함하는 각 격자 사각형에 대한 개요를 획득합니다. 배율 및 노출 시간이 총 전자 선량에 크게 추가하지 않고 TEM 이미지에서 기준 비드를 시각화하는 데 적합한지 확인합니다. 각 라멜라의 고해상도 TEM 맵(몽타주)을 획득합니다.
- 레지스터 및 3D-2D는 FLM 스택을 3DCT의 TEM 그리드 사각형 및 라멜라 개요와 연관시킵니다. 단계 3.6에서 기술된 바와 동일한 절차를 사용하여 형광(x, y, z - 가우시안 핏) 및 투과 전자 현미경 이미지에서 대응하는 비드 위치를 선택한다. 그런 다음 FLM 채널에서 관심 위치를 선택하고 TEM 개요로 전송합니다. 필요한 경우 FLM과 저배율 TEM 간의 첫 번째 상관 관계와 저배율 TEM에서 고배율 TEM의 두 번째 상관 관계로 구성된 2단계 절차를 사용합니다(그림 5).
- 수동으로(랜드마크까지의 거리 측정), SerialEM20 내에서 사용할 수 있는 등록 및 지도 도구 또는 CorRelator21과 같은 외부 소프트웨어를 사용하여 위치를 전송합니다.
- 상관된 위치에서 틸트 시리즈를 설정하고 실행합니다. 적절한 배율, 초점 흐림 및 총 선량을 사용하십시오(자세한 내용은 재료 표 및 표 1 참조). 라멜라에 의해 결정된 사전 기울기에서 획득을 시작하고(또한 단계 3.4의 주석 참조) 용량 대칭 기울기 방식22를 사용합니다. 수동 또는 배치 수집을 사용합니다.
그림 5: TEM에서 상관 위치의 위치 파악. 성공적인 3D 상관 FIB 밀링 및 투과 전자 현미경으로의 전송 후, FLM 스택의 기준 비드 (컬러 박스)와 TEM 개요 사이의 각 밀링 된 사각형에 대해 3D-2D 등록이 수행되어 cryo-ET (빨간색 원)의 잠재적 위치를 파악합니다. 그런 다음 더 높은 배율의 라멜라 개요(확대)를 획득하여 단층 촬영을 보다 정확하게 설정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
이 프로토콜은 EH 도메인 함유 및 엔도사이토시스 단백질 1(Ede1)-의존성 세포내 단백질 침착(END)과 자가포식체(autophagic bodies)에서의 분해 및 포획을 발견하는 데 사용되는 파이프라인에 대한 안내를 제공한다8. END는 S. cerevisiae의 액체-액체 상 분리 구획으로, 실패한 내세포 사건 후 클라트린 매개 엔도사이토시스(CME)에 관여하는 다양한 단백질을 완충합니다. 주요 구성 요소 중 하나는 Ede1이며, 이는 CME 구성 요소 및 이 새로운 LLPS 구획의 분해를 위한 선택적 자가포식 수용체의 두 배입니다. 따라서, 알코올 탈수소효소(ADH) 프로모터의 제어 하에 Ede1(EGFP-Ede1)의 EGFP 융합을 사용하여 END를 시각화했는데, 이는 Ede1 과발현이 엔도사이토시스의 초기 단계를 방해하여 LLPS를 구성적으로 유도하기 때문입니다.
EGFP-Ede1 과발현 효모 세포 및 1μm 기준 마커가 있는 플런지 동결 그리드에서 GFP 채널에서 FLM 스택 획득을 위해 5개의 위치를 선택했습니다(그림 6A; TFS Corrsight; 공초점 모드, 300nm 초점 스텝 크기, 10μm 범위). 그리드는 FIB 기기 (Quanta 3D FEG)로 전송되었고, FLM 스택이 획득 된 그리드 사각형은 형광 및 SEM 그리드 개요의 2D-2D 상관 관계를 수행하여 식별되었습니다 (3.2 단계 비교).
선택된 사각형 각각에 대해 이온 빔 이미지를 낮은 전류 (10 pA, 1200x 배율)로 촬영하고 해당 기준 위치를 3DCT에 등록했습니다. 관심 있는 생물학적 특징을 가진 위치를 선택하고 FLM 스택 내에서 3D 위치를 맞춘 후 발견된 변형을 추정 END 위치에 적용하고 라멜라 준비를 위한 부위를 선택했습니다(그림 6B). 그리드 표면에 대해 11 ° 기울어 진 FIB 빔이 여기에 표시된 예에서 사용되었습니다 (45 ° FIB 셔틀 사전 기울기, 18 ° 스테이지 기울기). 관심있는 위치가 전송되었고, FIB 패턴은 FIB 이미지에서 눈에 띄는 랜드 마크 (예 : 구멍, 얼음 오염, 기준 비드)에 대한 예측 된 위치의 거리를 측정하여 수동으로 그려졌습니다 (그림 6D). 등록의 정확도는 FLM 및 IB 이미지에서 명확하게 식별할 수 있는 비드를 의도적으로 생략한 다음 이온 빔 보기에서 실제 위치와 예측된 위치를 비교하여 평가되었습니다(예: 그림 6B, C의 다이아몬드). 도 6C 에 도시된 정사각형에 대한 상관은 정확한 것으로 밝혀졌다(즉, FLM 비드 위치의 예측된 위치는 그들의 대응하는 IB 위치 및 3DCT가 등록을 위해 보고한 서브-픽셀 RMSE 값과 완벽하게 일치하였다). 따라서, 라멜라는 예측된 위치(부위 B)에서 절단되고 ~200nm의 두께로 미세 밀링되었습니다(최종 패턴 오프셋).
그림 6: 효모에서 세포내 단백질 침전물(END)의 3D 상관 표적화에 대한 대표적인 결과. (A) 밀링 전 그리드의 SEM 개요. 색상이 있는 상자는 형광 스택을 미리 가져온 격자 사각형을 나타냅니다. (B-C) 그리드 사각형의 3D 상관 관계. FLM 데이터(B, 여기서는 최대 강도 투영으로 표시됨)와 이온빔 이미지(C)에 여러 개의 해당 기준 비드(컬러 박스)를 등록한 후, 다이아몬드로 표시된 비드의 위치를 예측하여 3D 등록의 정확성을 검증했습니다. 다음으로, 타겟 신호의 위치(빨간색 원)를 두 개의 잠재적 밀링 사이트에 대한 이온 빔 뷰에서 예측했습니다. (D) 3개의 표적 점점(빨간색 원)과 초기 밀링 패턴(노란색 상자)의 예측 위치를 보여주는 사이트 B의 확대. 네 번째 형광 펑크텀은 다른 펑타보다 훨씬 낮을 것으로 예측되어 밀링 동안 표적화되지 않았습니다(회색 원). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
성공적인 FIB 밀링 및 그리드를 극저온 투과 전자 현미경 (Titan Krios는 300kV에서 작동하고 Gatan K2 직접 전자 검출기 및 Bioquantum 에너지 필터 장착)으로 전송 한 후 그리드 개요를 SerialEM에 기록하고 라멜라가있는 사각형을 찾는 데 사용했습니다. 각 라멜라에 대해 개요 이미지를 획득하고 해당 기준 비드를 사용하여 FLM 데이터를 3DCT(3D-2D)에 등록했습니다. 관심있는 생물학적 특징의 위치 (그림 7A)는 그 후 기준 비드로부터 계산 된 변환을 사용하여 예측되었다. 더 높은 배율로 기록된 라멜라 개요를 스티칭하고 관심 부위를 명확하게 보이는 랜드마크(예: 기준점 구슬)를 사용하여 상관 관계를 파악했습니다. 대안적으로, 고전적인 CLEM 개요는 다양한 소프트웨어(10, 12)에서 생성될 수 있다.
상관관계에 기초하여, 도 7A에 도시된 라멜라에 대해 단층촬영 획득을 위한 4개의 잠재적 부위가 발견되었다. 그러나 여기에는 3D 상관 FIB 밀링 중에 타겟팅되지 않은 위치 (그림 6D 비교, 회색 원)와 얼음 오염으로 차단 된 위치 (그림 7, 회색 상자)도 포함됩니다. 따라서 단층 촬영은 두 위치에 대해서만 기록할 수 있었습니다(그림 7B). 전반적으로, ~75%의 상관관계 성공, 즉 TEM 및 END 구조로의 전달에서 살아남은 라멜라가 예측 부위에서 발견되었습니다(12개의 상관 부위). 단층 구조 재구성, 세분화 및 템플릿 매칭 후 개별 END 구조를 기본 컨텍스트 내에서 시각화할 수 있습니다(그림 7C,D). 여기에는 END를 둘러싸고 있는 천공된 소포체(ER), 때때로 접촉하는 지질 방울, LLPS 구획에서 제외되는 리보솜이 포함됩니다. 종합하면, 이것은 3D 상관 FIB 밀링이 손상되지 않은 세포에서 희귀 한 생물학적 과정에 대한 분자 수준 정보를 제공 할 수있는 방법을 보여줍니다.
그림 7: cryo-ET로 END를 시각화한 대표적인 결과. (A) 그림 6에 표시된 밀링 현장의 저배율 TEM 개요는 FLM 최대 강도 투영(그림 6B)과 쉽게 상관관계를 파악하여 관심 있는 생물학적 특징(적십자)을 국소화할 수 있습니다. (B) 두 번째 단계에서는 더 높은 배율(스티치) 뷰를 상호 연관시킬 수 있으며 단층 촬영 위치(노란색 상자)를 설정할 수 있습니다. 면외 신호(회색 상자, 그림 6D 비교)로 인한 위치는 무시되었습니다. (C-D) 이 3D 상관 FIB 접근법을 사용하여 내세포 단백질 침착 (END)을 기본 환경에서 시각화 할 수 있습니다. 소포체(ER), 리보솜, 막 및 지질 방울과 같은 구조를 식별하고 시각화할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라즈마 클리너 설정 | |||
| Harrick 플라즈마 클리너 PDG-3XG : | 고주파 setiing: "HI", 30초; N2 플라즈마 | ||
| 플런저 설정 | |||
| TFS Vitrobot Mk IV 크랙: | 100% 습도; 얼룩 = 8; 블로트 타임 = 10초; 대기 시간 0초; (이것은 대부분의 현탁 및 부착 세포에서 작동해야 함) | ||
| FIB GIS 위치 및 타이밍 | |||
| Quanta 3D FEG 크랙: | 틸트 = 0, 회전 = -180, Z 위치 = 13.5, 온도 설정값 = 26.15°, 시간 = 8초 | ||
| TFS Scios 크랙: | 틸트 = 0, 회전 = -180, Z 위치 = 9.8, 온도 설정값 = 28°C, 시간 = 7초 | ||
| TFS 아퀼로스 1: | 소프트웨어 사전 정의 위치, 온도 설정값 = 28°, 시간 = 7초 | ||
| TFS 아퀼로스 2: | 소프트웨어 사전 정의 위치, 온도 설정값 = 28°, 시간 = 7초 | ||
| FIB 스퍼터 코터 설정 | |||
| 쿼럼 시스템: | 쿼럼 준비 챔버: 10 mA, 40 s | ||
| TFS Scios 크랙: | 10W, 500V, 250mA, 0.2mbar, 15초 | ||
| TFS 아퀼로스 1: | 1kV, 10mA, 10Pa, 15초 | ||
| TFS 아퀼로스 2: | 1kV, 10mA, 10Pa, 15초 | ||
| 단층 촬영 | |||
| 타이탄 크리오스 Gi2 | K2 카메라, Gatan Bioquantum 에너지 필터 | ||
| 20 eV 슬릿; 2° 단계의 선량 대칭 기울기 방식(Hagen); +10°(라멜라 사전 기울기!)에서 +70° 및 -50°까지 시작 | |||
| 타이탄 크리오스 Gi4 | 팔콘 4; Selectris X 에너지 필터 | ||
| 10 eV 슬릿; 2° 단계의 선량 대칭 기울기 방식(Hagen); +10°(라멜라 사전 기울기)에서 시작하여 +70° 및 -50°까지 | |||
| FLM 인수 | |||
| Corrsight(컨포칼 모드) | 목표: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; 스택 획득 매개변수: xy 픽셀 크기 = 161.25nm, z 스텝 크기 = 300nm. | ||
| 라이카 SP8 Cryo-Confocal | 대물렌즈: 라이카 HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; 스택 획득 파라미터: xy 픽셀 크기 = 84nm, z 스텝 크기 = 300nm. | ||
표 1: 테스트된 장비 및 제안된 설정 목록.
Discussion
1. 프로토콜의 중요한 단계
세포 배양 및 그리드 플런징 파라미터의 최적화는 이 워크플로우의 기본입니다. 프로젝트를 시작할 때 태깅 전략, 세포 및 기준 비드의 분포를 최적화하고 다양한 그리드 준비 및 블로팅 매개변수를 테스트하는 데 시간을 투자할 가치가 있습니다. 최적으로 플런지 냉동 샘플로 작업하면 다운스트림 처리가 크게 용이해집니다.
모든 TEM 실험의 경우 유리체 샘플이 필요합니다. HeLa와 같은 대형 포유류 세포의 경우 격자 정사각형당 1-2개의 세포가 바람직하지만 세포는 여전히 더 높은 밀도에서 유리체일 수 있습니다. 임의로, 유리화는 포유류 세포(예를 들어, HEK293, HeLa)를 급락하기 10분 전에 배양 배지에 첨가된 2.5-10%(v/v) 글리세롤과 함께 배양함으로써 개선될 수 있다23. 가능하다면, 그리드 패터닝은 세포의 완벽한 배치 및 분포를 보장하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 유리화 및 추후 상관관계를 개선한다(24).
워크플로우 중에 특정 세포를 선택할 수 있지만 관심 있는 생물학적 특징을 나타내는 세포가 너무 적으면 전체 처리량이 크게 감소합니다. POI 양성 세포의 상관관계를 개선하려면 충분히 밝은 형광단을 사용해야 합니다. 이것은 내인성 발현 수준에서 특히 중요합니다. 우리는 극저온 조건에서 mVenus가 증가된 밝기25 와 극면 변색 이동으로 인해 EGFP보다 더 나은 성능을 발휘하여 극저온 조건26에서 표준 GFP 필터 설정에 적합하다는 것을 발견했습니다. 점과 같은 표적 구조가 아닌 경우, 파장과 국소화 정확도(Abbe 회절 한계) 간의 균형도 고려해야 합니다.
효율적인 3D 상관 관계를 위해서는 그리드가 기계적으로 안정적이어야 하며 세심한 주의를 기울여 처리해야 합니다. 탄소 지지를 갖는 표준 금 또는 구리 그리드가 사용될 수 있지만, 프로젝트에 따라 더 단단한 SiO2 필름을 사용함으로써 성공률이 크게 증가 할 수있다. 그러나 (a) 기계적 안정성 또는 (b) 극저온주름을 줄이기 위한 열팽창 계수(기판 대 필름)의 일치가 성공적인 3D 상관관계를 위한 가장 중요한 요소인지 여부는 아직 결정적으로 결정되지 않았습니다. 또한, 깨지기 쉬운 Au 그리드를 집어 올리기 위해 폴리디메틸실록산 코팅 접시를 사용할 수 있습니다5.
샘플 안정성을 보장하는 것 외에도 FIB 밀링 중 최적의 타겟팅에 적합한 고품질 형광 스택을 얻으려면 FLM 이미징 매개 변수를 신중하게 선택해야합니다. 이와 관련하여, FLM 데이터에 대해 다양한 노이즈 제거28 또는 디콘볼루션 기술을 테스트하는 것도 권장되는데, 이는 기준점 및 세포 신호의 국소화를 상당히 향상시킬 수 있기 때문입니다. 형광 신호를 FIB-SEM 이미지와 연관시킬 때 기준 비드의 적절한 샘플링이 중요합니다. 그것들은 세포 주위에 잘 분포되어 있어야 하며 아마도 다른 z 높이에 있어야 합니다. 또한 신탁 모델에서 의도적으로 제외되었지만 눈으로 명확하게 상관 관계를 나타낼 수 있는 비드의 예측 위치와 실제 위치를 확인하여 상관 관계의 일관성을 검증하는 것이 좋습니다. 3DCT의 RMSE 값도 등록 일관성을 확인하기 위해 항상 고려되어야 합니다.
FIB-SEM 챔버에서 밀링된 재료와 잔류물을 증착(즉, 재오염)하면 양쪽에 비정질 재료를 추가하여 유효 라멜라 두께가 증가하기 때문에 현미경에서 미세 밀링된 라멜라를 장기간 유지하면 일반적으로 추가 전자 산란 이벤트로 인해 TEM 데이터 품질이 저하됩니다. 따라서, 밀링은 2-단계 방식으로 가장 자주 수행된다: 첫째, 모든 위치들은 대략적으로 (즉, 약 800 nm까지), 그 다음 미세하게 (~150-250 nm까지), 그리드는 마지막 라멜라가 완료된 후에 즉시 언로딩된다. 그러나 더 나은 상관 관계 성공은 관심 위치를 현장별 방식으로 처리하여 얻을 수 있으며, 따라서 굽힘 또는 변형을 위한 시간이 없기 때문에 동일한 라멜라에서 서로 직접 거칠고 미세한 밀링을 수행할 수 있습니다. 그러나 이것은 시스템의 재오염 속도에 따라 그리드당 생산할 수 있는 최대 라멜라 수를 줄입니다. 20 nm / h의 속도의 경우, 4-6 라멜라는 1-1.5 시간 이내에 생성됩니다.
전체 그리드 또는 거친 분쇄된 라멜라>300nm의 이동은 상관관계가 좋지 않거나 실패하는 결과를 초래합니다(아래에서 논의되는 제한 사항 참조). 따라서 FIB 밀링 전, 도중 및 후에 IB 이미지를 비교하여 정기적으로 점검해야합니다. 상당한 움직임(>300nm)을 보이는 부위는 폐기해야 합니다. 시료 전처리(즉, 그리드 유형, 세포 밀도 및 플런징 파라미터 선택, 프로토콜 섹션 1 참조)와 밀링 전략을 최적화하여 이러한 이동을 방지합니다. 라멜라 굽힘은 단계 3.6에 설명된 바와 같이 부위별 밀링에 의해 상당히 감소될 수 있고 라멜라 폭을 감소시킬 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 응력 완화 컷(15 )은 라멜라 굽힘을 감소시키기 위해 고안되었지만, 종종 분리된 라멜라의 조화로운 움직임을 초래하여 상관관계를 효과적으로 방지한다. 통합 FLM 시스템을 사용하여 이 문제를 해결할 수 있습니다.
2. 방법의 수정 및 문제 해결
극저온 조건으로 이동하기 전에 생세포 이미징에서 샘플의 철저한 특성화를 수행하는 것이 좋습니다. 세포 샘플, 처리 계획을 최적화하고 cryo-workflow에 들어가기 전에 어떤 종류의 신호를 기대해야 하는지 알면 성공률을 크게 향상시킬 수 있습니다.
여기에 제시된 워크플로우에서는 극저온 스테이지가 있는 독립형 형광 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화한 다음 그리드를 집속 이온빔 현미경으로 전송합니다. 그러나 형광 현미경이 FIB-SEM 챔버에 통합 된 시스템에서 테스트되었으므로 형광 이미지 29,30,31을 획득하기 위해 샘플 이동이 필요하지 않습니다. 이러한 통합 시스템을 사용하여 FIB 밀링 중 및 후에 관심 위치를 이미지화하여 최종 라멜라를 오염시킬 위험을 증가시키지 않고 표적 형광 신호의 존재를 확인할 수 있습니다. 그러나 사용된 현미경의 광학 파라미터를 염두에 두는 것이 중요한데, 예를 들어 NA 대물렌즈가 낮으면 기준 비드와 표적 신호의 위치를 파악할 수 있는 정밀도가 제한되기 때문입니다. 그럼에도 불구하고 통합 FLM 설정은 FLM 스택을 지속적으로 업데이트하고 최신 SEM 및 IB 보기와 비교할 수 있으므로 그리드 및 라멜라의 약간의 변형을 더 잘 처리하는 데 도움이 됩니다.
FIB 밀링과 TEM 데이터 수집 사이의 라멜라의 형광 이미징에 대한 대안으로, TEM 후 상관 관계를 사용하여 라멜라의 올바른 배치 및 밀링을 확인할 수 있습니다 5,6.
상관 워크플로우의 모든 단계에서, 특히 TEM 동안에는 FIB-SEM/TEM 이미지에 투영된 형광 데이터의 오버레이를 생성하는 것이 좋습니다. 이러한 고전적인 CLEM 관점은 세포의 어느 부분이 라멜라 내에 포함되어 있는지 보다 직관적으로 이해하는 데 도움이 됩니다. 이는 상관 관계의 정확성을 확인하는 데 유용한 온전성 검사 역할도 합니다.
3. 방법의 한계
3D 상관 FIB 접근법에는 기준 비드와 함께 제공 할 수있는 샘플이 필요합니다. 따라서, 이 방법은 현재 플런지 냉동 그리드로 제한된다. 고압(HPF) 냉동(조직) 샘플의 경우 현재 2D-2D 상관관계만 수행할 수 있습니다. 잠재적으로, 내부 기준 마커(예를 들어, 세포 소기관, 염색된 지질 방울)가 이 문제에 대한 해결책이 될 수 있다32,33. 최종 상관 관계 성공률은 샘플 품질, 형광 현미경 설정, 라멜라 두께 및 표적 구조의 크기를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 기술된 3D 정합 접근법을 사용한 상관 정확도는 최종 IB 이미지에서 200-300 nm의 범위인 것으로 추정되며, 이는 FIB-밀링된 라멜라의 전형적인 두께에 대략 대응한다7. 따라서 이보다 훨씬 작은 세포 구조는 현재로서는 표적으로 삼기 어려울 것입니다. 또한 밀링 현장(>300nm)에서의 과도한 움직임은 상관관계의 정확도를 감소시키는데, 이는 FIB/SEM 기기에 통합된 FLM 설정으로 잠재적으로 해결할 수 있는 문제입니다. 밀링 중에 강한 변형 또는 굽힘을 보이는 라멜라는 어떤 경우에도 다운스트림 워크플로에서 제외되어야 합니다.
전반적으로, 초저온 형광 이미징은 현재 Abbe 회절 기준에 의해 제한됩니다. 초분리능 Cryo-FLM 분석법의 보다 일상적인 적용(및 상용화)을 통해, 특히 온더플라이(on-the-fly) 작동을 위해 FIB/SEM에 통합될 때 세포 구조의 보다 정확한 표적화가 가능해질 수 있습니다.
4. 방법의 중요성
특히 비 표적 및 사후 상관 기술과 비교할 때 3D 상관 FIB 밀링 접근 방식을 사용하면 시간과 자원이 많이 소요되는 TEM 단계 전에 적절한 위치를 선택할 수 있습니다. 따라서 보다 효율적인 데이터 수집 및 프로젝트 계획이 가능합니다. 또한, 상관관계가 있는 형광 데이터는 특히 구조화되지 않은 단백질 어셈블리 또는 템플릿 매칭 및 서브토모그램 평균화를 위해 너무 작은 것을 다룰 때 단층 촬영을 해석하고 다중 스케일 프로젝트에서 Cryo-ET 결과를 통합하는 데 중요할 수 있는 정보 계층을 추가합니다.
5. 중요성과 잠재적인 미래 응용 분야
HPF 샘플 34,35, cryo-FIB-SEM 볼륨36 및 초고해상도 형광 이미징 26,37,38,39의 cryo-lift와 같은 고급 워크플로우와 함께 3D 표적 라멜라 준비는 분리된 세포에서 생물학적 과정을 해부할 뿐만 아니라 조직 및 환자 샘플을 FIB 밀링 및 초저온 전자 단층 촬영에 접근할 수 있도록 합니다. 따라서 고해상도에서 병리학적 과정을 해부할 수 있으므로 나노 규모의 생검을 위한 필수 구성 요소가 될 것입니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
IT 인프라를 지원해 준 Inga Wolf, 컴퓨터 지원을 해준 Florian Beck, 원고를 비판적으로 읽어준 Oda H. Schiøtz에게 감사드립니다. 자금은 Philipp S. Erdmann의 Alexander von Humboldt 귀환 펠로우십과 Florian Wilfling의 EMBO 장기 펠로우십 ALTF 764-2014를 통해 부분적으로 제공되었습니다. 안나 비버(Anna Bieber)는 베링거인겔하임 재단(Boehringer Ingelheim Fonds) 박사 펠로우십의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
| C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
| Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
| Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
| EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
| Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
| FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
| FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
| K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
| Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
| Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
| Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
| THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
| Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |
References
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