Summary
采用多重 原位 杂交（ISH）来同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合物中两个G蛋白偶联受体和一个转录因子的转录物。该协议可用于生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。
Abstract
本研究描述了小鼠颈静脉结节多重 原位 杂交（ISH）的方案，特别强调检测G蛋白偶联受体（GPCRs）的表达。使用RNAscope技术处理福尔马林固定的颈静脉结节，以同时检测两个代表性GPCR（胆囊收缩素和ghrelin受体）的表达，并结合一个标记基因的结节（成对的同源盒2b，Phox2b）或颈静脉传入神经元（PR结构域锌指蛋白12，Prdm12）。使用共聚焦显微镜对标记的神经节进行成像，以确定上述转录本的分布和表达模式。简而言之，发现Phox2b传入神经元大量表达胆囊收缩素受体（Cck1r），但不是ghrelin受体（Ghsr）。还发现了Prdm12传入神经元的一小部分来表达Ghsr和/或Cck1r.讨论了多重ISH的设计，处理和解释中潜在的技术警告。本文中描述的方法可能有助于科学家生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。
Introduction
迷走神经传入者的细胞体包含在颈静脉，岩质和结节1，2，3中。它们的轴突通过迷走神经的几个分支一起传播到颅颈，胸部和腹部区域4，5，6，7。从它们的内脏末端，迷走神经传入物可以对广泛的生理和有害刺激做出反应8，9，10。然而，参与迷走神经传感的信号分子和受体的分布仍然很差。这部分是因为迷走神经节尽管体积小，但表达的受体范围很广，包括大量的GPCR8，11，12，13。此外，迷走神经传入神经元本质上是异质的，并且显示出不同的分子谱14。更复杂的是，颈静脉、岩神经节和结节附着在小鼠体内，从而形成单个神经节肿块。最后，在动物亚群中，结节连接到交感神经节上颈神经节15。
过去，研究人员已经转向免疫组织化学来研究迷走神经传入神经元的神经化学组成16，17，18。虽然使用经过验证的抗体进行免疫组化是有用的，但必须谨慎解释免疫组化研究的结果。例如，许多鉴定GPCR特异性抗体的努力都失败了19，20，21，22，23，24，25，导致研究人员得出结论，大多数针对GPCR的抗体是不可靠的。为了规避这些问题，定量PCR（qPCR）已被广泛用于评估啮齿动物迷走神经节质量26，27，28，29中的基因表达。然而，使用qPCR检查基因表达是以空间信息丢失为代价的。特别是，无法预测有多少细胞或什么细胞类型表达特定的目的基因（例如，结节细胞与颈细胞）。反复出现的问题还包括邻近组织的污染以及在解剖过程中包括可变长度的迷走神经，颈部上部和颈神经节15。由于上述困难，围绕迷走神经传入神经元中几种GPCR的表达和分布存在争议。一个特别令人费解的例子与ghrelin受体（Ghsr）有关。虽然一些研究发现这种受体在迷走神经传入神经元30，31，32中广泛表达，但其他人发现Ghsr mRNA在结节11，14中几乎检测不到。因此，有必要在迷走神经节质量中详细绘制Ghsr mRNA。
原位杂交（ISH）也被用于评估迷走神经节质量7、11、12、33、34、35的基因表达模式。因为在大多数情况下，基于RNA的技术仍然比基于抗体的技术更可靠和特异性36，37，ISH的研究已被证明对更好地理解迷走神经传入神经元的神经化学编码是有价值的。尽管如此，传统的ISH技术本身并非没有警告。放射性ISH是敏感的，但会产生背景，并且仍然很麻烦38。非放射性ISH不那么复杂，但也不那么敏感38。相比之下，最近开发的RNAscope ISH方法具有高度灵敏度，并且产生最小的背景39。目前的研究将多重荧光RNAscope应用于检测小鼠迷走神经传入神经元中的GPCR。我们专注于绘制Ghsr的分布图，并将其分布与胆囊收缩素受体（Cck1r）的分布进行比较，胆囊收缩素受体（Cck1r）是另一种已知在结节34中表达的GPCR。最后，将两种转录因子，成对的同源盒2b（Phox2b）和PR结构域锌指蛋白12（Prdm12）分别用作结节和颈静脉传入神经元的选择性标记物14。如果不可视化Phox2b或Prdm12，则很难确定地识别颈静脉传入物与结核传入物。本文还讨论了潜在的技术陷阱。
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Protocol
注意：本研究中使用的小鼠是纯C57BL / 6J背景上的野生型雄性。总共使用4只小鼠进行多重ISH。所有小鼠在牺牲时大约8周大。一只雄性小鼠（约一岁）也用于证明与衰老相关的内源性荧光。动物被关在屏障设施内的通风笼子里 ，可以随意 获取食物和水。UT西南医学中心机构动物护理和使用委员会审查并批准了下述程序。有关试剂和工具的详细信息，请参见 材料表。
1. 样品采集
- 在牺牲当天，向小鼠施用过量的水合氯醛（500mg / kg，ip）。使用蠕动泵将深度麻醉的小鼠经心电泳和5 mL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下灌注50 mL的10%福尔马林。
注意：这是在通风橱中完成的，以防止吸入福尔马林。 - 当结节，岩和颈神经节融合在小鼠15中形成单个神经节性团块时，在解剖镜和细弹簧剪刀和镊子的帮助下，小心地从每侧（左右）收集整个迷走神经节团团（见 材料表）。
- 当用一把大剪刀斩首小鼠时（见 材料表），避免压碎脑干。
- 按照前面在大鼠40中描述的解剖方法，用小镊子（材料表）去除气管外侧的胸骨和舌骨肌肉，以暴露枕骨。清除整个肌肉、脂肪组织和结膜组织区域，直到颈动脉、迷走神经、舌下神经和大孔可见。用小弹簧剪刀切开整个舌下神经（材料表）。
- 寻找结节作为靠近大孔15的半透明肿块。使用小剪刀（材料表），小心地折断枕骨，以进一步暴露颈神经节。在颈静脉表面寻找黑色素细胞作为视觉地标。
- 切断迷走神经节肿块之间的神经附件，并通过轻轻拉动迷走神经的外周端来提取整个神经节肿块，同时用小弹簧剪刀将颈神经节切向脑干（材料表）。
- 尽可能去除粘附在迷走神经和神经节肿块上的结膜组织和脂肪。
- 由于在从一根管子转移到另一根管子的过程中很容易失去一个神经节，因此请保持约0.5cm的迷走神经，以便于处理和定位样品。
- 在细镊子的帮助下将神经节置于1.5mL微量离心管中，并在福尔马林中在4°C下孵育24小时，再用30%蔗糖孵育24小时。
- 将神经节放置在一块铝箔上最佳切割温度（OCT）介质的小液滴（~4 mm Ø）内。接下来，将样品冷冻在干冰床上。
- 用低温恒温器在-20°C下将样品切割成14μm厚度的切片，并收集在玻璃显微镜载玻片上，作为3个系列42μm的间隔。
注： 避免将部分靠近幻灯片的边缘放置。为了保存试剂，请保持组织切片尽可能紧密地包装，但不要重叠。 - 将样品储存在-80°C冰箱中，直到ISH需要至少6个月。
注：有关内源性荧光的故障排除，请参阅图1。
2. 预处理和ISH
- 在实验日之前，高压灭菌器实验室玻璃器皿用于ISH，包括染色皿和洗涤缓冲罐。
注意：虽然在无RNase条件下工作并不重要，但请始终戴上手套。将RNase去污液瓶（材料表）放在触手可及的地方，以防怀疑污染。 - 在第一天，将载玻片带到室温，放在专门用于ISH的长凳上。在1x PBS中冲洗载玻片，并在烘箱中在60°C下烘烤30分钟（材料表）。
- 将载玻片在4%福尔马林中后固定15分钟，在4°C下。
- 将多重试剂盒（材料表）中的试剂带到室温。
- 将载玻片在50%，70%和100%乙醇中脱水5分钟。将H2O2 溶液涂在样品上10分钟，然后在双蒸馏水（ddH2O）中冲洗。
- 用目标检索试剂处理样品5分钟，在ddH2O中冲洗，然后用100%乙醇冲洗，然后风干。使用疏水笔，在样品周围形成屏障。
注意：不要将疏水屏障敷得太靠近组织切片。 - 在杂交炉中在40°C下施用蛋白酶30分钟（材料表）。
- 同时，在使用前将探头预热至40°C并在室温下冷却。将载玻片与目标探针（Cck1r-C3，Ghsr-C1，Phox2b-C2;或Ccck1r-C3，Ghsr-C1，Prdm12-C2）组合在杂交炉中在40°C下孵育2小时。
- 用二氢二吡啶甲酸还原酶（DapB）靶向C1探针在杂交炉中在40°C下孵育阴性对照组织2小时。
- 在洗涤缓冲液中冲洗载玻片，并在室温下在5x盐水柠檬酸钠（SSC）中储存过夜。为方便起见，将实验分成两天。第二天，用洗涤缓冲液冲洗载玻片，并用下面列出的扩增试剂孵育它们（参见 材料表中的用户手册）。
- 应用AMP1（在40°C下30分钟），AMP2（在40°C下30分钟）和AMP 3（在40°C下15分钟）。在每个步骤之间用洗涤缓冲液冲洗。
- 将每种蛋白石染料（材料表）溶解在二甲基亚砜中，并将溶液储存在4°C直至需要。
- 对于通道 1，用 HRP-C1（在 40 °C 下 15 分钟）和 Opal 520（绿色;稀释 1/1，500;在 40°C 下 30 分钟）孵育载玻片。在每个步骤之间用洗涤缓冲液冲洗。
- 对于通道 2，用 HRP-C2（在 40 °C 下 15 分钟）和 Opal 570（黄色;稀释 1/1，500;在 40 °C 下孵育 30 分钟）孵育载玻片。在每个步骤之间用洗涤缓冲液冲洗。
- 对于通道 3，用 HRP-C3（在 40 °C 下 15 分钟）和 Opal 690（远红色;稀释 1/1，500;在 40 °C 下孵育 30 分钟）孵育载玻片。在每个步骤之间用洗涤缓冲液冲洗。
- 洗涤载玻片并将其暴露于4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）中30秒。
- 立即在每张载玻片上涂抹安装介质，并在组织切片上放置盖玻片。
- 将组织水平保持在4°C的载玻片支架中，直到成像。
3. 显微镜和数据分析
注意：多重ISH数据可以使用各种仪器使用适当的过滤器进行成像。然而，首选的成像方法是具有20x和63x（油）物镜的共聚焦显微镜;有关原因，请参阅讨论。有关最佳信噪比的确定，请参阅图2。
- 使用配备488、561和633 nm激光线的共聚焦显微镜。使用以下采集参数（见 表1）：蛋白石690（HeNe 633 nm，检测范围668-696 nm，功率2.0，增益724）;蛋白石 570（DPSS 激光 561 nm，检测范围 579-627 nm，<功率 15.0，<增益 450）;蛋白石 520 （氩激光 488 nm， 探测范围 499-535 nm ， <功率 6.0， <增益 830）;DAPI（二极管激光器405，检测范围415-502 nm，<功率12.0，<增益532）。
- 要提高图像质量，请采集时的线平均为 4，像素大小至少为 1024 x 1024。
注意：以上参数仅作为示例提供，建议根据一种仪器，放大倍率（20x或63x），表达水平和任何给定组织的内源性荧光水平进行修改。 - 一旦对采集参数感到满意，使用相同的设置收集图像。将假颜色归因于每个通道，以便于可视化。
注意：例如，红色（Phox2b 或 Prdm12）、青色 （Cck1r）、黄色 （Ghsr） 和灰色 （DAPI）。 - 使用数字图像进行细胞计数，方法是用DAPI轻轻染色一个细胞核识别RNAscope阳性谱的轮廓。计算表达每个转录本的RNA镜阳性谱的百分比[图3A-C]。
- 为了提高估计的严谨性和准确性，请计算来自至少4种不同动物的至少2，000个神经元谱。分别从左神经节和右神经节进行计数。
- 在饼图中输入数据，其中包含已计数配置文件的总数。
- 使用成像软件采集图像并将 20 倍图像拼接在一起。使用ImageJ-Fiji和另一个照片和设计软件来生成最终的印版。对所有图像均匀地应用对比度和亮度调整。
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Representative Results
虽然RNAScope可以应用于任何年龄，性别或遗传背景的动物，但建议与年轻人（<3个月大）一起工作。这是因为荧光伪影（例如，脂褐素）是老年动物神经元中的常见发现41。来自老年小鼠的福尔马林固定神经节通常含有令人惊讶的强烈内源性荧光，很容易被误认为是真正的染色（图1A，B）。在任何情况下，建议在处理之前验证组织中内源性荧光的水平。
使用与DapB阴性探针一起孵育的阴性对照组织的切片来确定每种激光器的最佳采集参数和信噪比非常重要，如图2A，B所示。由于DapB是原核基因，因此阴性对照组织中应完全不存在RNAscope信号。除了偶尔的碎片和晶体外，只要使用适当的采集参数，在阴性对照组织的图像中可以看到可以忽略不计的荧光。然而，在一定的激光功率和增益以上，不需要的背景和随机荧光点开始出现（图2C）。最小化激光功率的另一个目的是避免像素饱和和光漂白。使用上述参数时，未观察到荧光漂白的主要问题。如果可能出现此类问题，除了尽可能降低激光功率外，建议使用荧光标记细胞的安装介质覆盖组织（材料表）（参见表1中的推荐参数）。
RNAscope技术用于检测小鼠迷走神经节质量组织切片中的3个基因（图3和图4）。当看到黄色和/或青色点分别覆盖一个填充有红点的轮廓时，Ghsr和/或Cck1r的一个轮廓被认为是阳性的（图3A-C）。图3中给出的示例显示了许多包含Phox2b和Cck1r转录本的配置文件（图3D）。Phox2b用于识别结卵传入神经元。丰富的Phox2b信号积聚在结节神经节的神经元中（图4A，B）。在大约52%的Phox2b细胞中检测到Cck1r信号（图4C）。值得注意的是，Cck1r的表达水平在细胞之间差异很大，从中等（每个轮廓约20个点）到强烈的标记（细胞质填充）。相比之下，Ghsr的信号在结核神经节中非常稀疏（图4A，B）。据估计，只有0.65%的Phox2b阳性细胞对Ghsr转录本也呈阳性（图4C）。表达Ghsr的细胞通常共表达Cck1r。对组织的视觉调查没有发现左右神经节之间的明显差异。在没有神经元的区域（例如，肾上腺素和纤维束）中，ISH信号几乎不存在。
Prdm12用于识别颈静脉传入神经元。正如预期的那样，Prdm12表达在颈神经节的神经元中高度丰富，并且一些神经元浸润了结节的喙部（图5A-C）。有趣的是，在Prdm12细胞的一个子集中检测到Cck1r信号（图5B，C）。略低于9%的Prdm12阳性神经元也表达Cck1r（图5D）。然而，颈神经节仅包含具有中等水平Cck1r（每个细胞<20个点）的细胞，而不是通常在结节中发现的强烈标记的Cck1r阳性细胞。Ghsr阳性细胞在颈静脉中比在结节中明显更常见（图5C）。大约3%的Prdm12细胞也是Ghsr阳性（图5D）。有趣的是，所有Prdm12中有1%共同表达Ghsr和Cck1r.Ghsr的表达水平始终是中等的（每个细胞<20个点）。在没有神经元的区域看不到ISH信号。
图1：内源性荧光问题的故障排除（A，B）一只衰老小鼠（约1岁）的结节/颈神经节中的内源性荧光。使用与年轻小鼠用于多重ISH的颜色和采集参数相同的激光线通过共聚焦显微镜获取数字图像（见后面）。重要的是，除了储存在-80°C并暴露于DAPI之外，固定组织没有以任何方式处理。如A所示，在神经元和非神经元细胞中观察到大量不需要的荧光，特别是当暴露于488nm激光（绿色）时。这是组织学中的常见发现，需要在组织学分析之前评估内源性荧光。（B）在更高的放大倍率下，荧光类似于脂褐素色素，经常积聚在衰老细胞中，很容易被误认为是真正的免疫反应性和/或RNAScope信号。比例尺 = 158 μm （A） 和 15 μm （B）。缩写：DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NG = 结节神经节;ISH =原位杂交。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：确定最佳信噪比（A，B）阴性对照，包括原核基因DapB的RNAScope检测。请注意，年轻成年小鼠的结节神经节中的内源性荧光是最小的，并且与DapB探针孵育不会产生信号。采集参数与用于多路复用ISH的参数相同。这表明，如果仔细选择采集参数，RNAScope程序本身不会产生任何重要的背景。（C） 在增加功率激光器和488 nm激光器增益时获得的相同组织的数字图像。请注意一些模糊的绿色背景和偶尔的点是如何在一定的激光功率和增益之上出现的。因此，根据在阴性对照组织中获得的非特异性荧光量仔细选择每个激光器的采集参数非常重要。比例尺 = 158 μm （A） 和 15 μm （B， C）。缩写： DapB = 二氢二吡啶甲酸还原酶;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NG = 结节神经节;ISH =原位杂交。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：阳性轮廓的识别和计数。 （A） 在结核神经节的喙部中 Phox2b 标记的轮廓（红色）的代表性数字图像。在此示例中，共标识了 18 个细胞配置文件（标记为 1 到 18 个）。请注意，DAPI染色进一步有助于定位神经元，神经元通常显示一个大而圆的细胞核，并带有轻微的DAPI染色。相反，非神经元细胞的细胞核标记明亮，细长，尺寸更小。总体而言，RNAScope信号符合神经元细胞而不是非神经元细胞的分布和形状。（B） 显示两个标记的 Ghsr 阳性神经元（黄色）（配置文件 19 和 20）。Ghsr信号稀疏且难以看到。因此，在照片软件中，黄色信号的亮度和饱和度被选择性地均匀地增强。（C） 共识别出 9 个 Cck1r 标记的轮廓（青色）（标记为 2、5、8、11、14、17、18 和 19）。请注意Cck1r信号的强度在细胞之间差异很大。例如，配置文件 11 仅包含少量正信号，而配置文件 7 几乎充满了 Cck1r 信号。（D） 所有通道的合并视图允许识别共定位模式。许多 Phox2b 阳性谱也共表达 Cck1r（例如，谱 2、8 和 14），如同一细胞谱内的红色和青色 RNAScope 点所证明的那样。相比之下，Phox2b阳性谱不表达Ghsr转录本（谱19和20）。然而，一个Ghsr阳性细胞也表达了低水平的Cck1r（剖面19）。两个标有白色星号的大型DAPI染色的细胞核可能对应于没有RNAScope信号的Phox2b阴性传入神经元的位置。在下面描述的代表性结果中，从4种不同动物的左右神经节质量中计算了至少2，000个神经元谱。比例尺 = 24 μm。缩写： DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;Phox2b = 成对的寄存器 2b;Ghsr = ghrelin受体;Cck1r =胆囊收缩素受体。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：多重ISH在结卵传入神经元中的代表性结果。用多重RNAscope标记Phox2b，Cck1r和Ghsr的代表性迷走神经节质量的数字图像，图像是用共聚焦显微镜（蔡司LSM880）的20x（A）和63x（B，C）物镜获得的。在A、20×中，几个图像使用Zen软件拼接在一起，呈现为未混合的通道或合并的通道。Phox2b信号（红色）特异性地积聚在位于结节神经节中的传入神经元中。正如预期的那样，Cck1r信号（青色）强烈地标记了结节神经节中的许多（但不是全部）神经元。在低放大倍率下，表达低水平Cck1r或任何具有Ghsr信号（黄色）的细胞不容易观察到。DAPI（灰色）有助于可视化组织并识别具有大而轻微染色的细胞核的迷走神经传入神经元。合并图像中的白色插图对应于下面包含的图像的位置。（B） 在高放大倍率下，Phox2b 阳性轮廓（红色）明显。许多细胞也表达Cck1r，但水平不同，从中等到非常高。配置文件"1"是Cck1r和Ghsr的Phox2b细胞阴性的示例，配置文件"2"和"3"分别是具有高和中Cck1r信号的Phox2b细胞。Ghsr（黄色）的中度信号偶尔在喙结节中看到，但几乎总是在Phox2b阴性的细胞中，如轮廓"4"所示。有趣的是，配置文件"4"表示Ghsr和Cck1r。如下图所示，Ghsr在Prdm12细胞中含量更高。（C） 饼图总结了共表达 Ghsr（黄色）、Cck1r（青色）或两者（灰色）的 Phox2b 细胞（红色）的百分比估计值。计数轮廓的总数显示在图表旁边（n = 4个不同的神经节，左右组合）。每一方的结果都被合并，因为没有注意到差异。比例尺 = 158 μm （A） 和 15 μm （B）。缩写： DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NG = 结节神经节;JG = 颈神经节;ISH =原位杂交;Phox2b = 成对的寄存器 2b;Ghsr = ghrelin受体;Cck1r =胆囊收缩素受体。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：颈静脉传入神经元多重ISH的代表性结果。用多重RNAscope Prdm12，Cck1r和Ghsr标记的代表性迷走神经节质量的数字图像，使用共聚焦显微镜（蔡司LSM880）的20x（A）和63x（B，C）物镜获取图像。在A、20×中，几个图像使用Zen软件拼接在一起，呈现为未混合的通道或合并的通道。Prdm12转录本（红色）特异性地积聚在位于颈神经节的传入神经元中，并且只有少数神经元浸润到结节神经节的喙部。Cck1r信号（青色）强烈标记结核神经节。在低放大倍率下，表达低水平Cck1r或任何具有Ghsr信号（黄色）的细胞不容易看到。DAPI（灰色）有助于可视化组织并识别具有大而轻微染色的细胞核的迷走神经传入神经元。合并图像中的两个白色插图对应于下面包含的图像的位置。（B， C）在高放大倍率下，可以描绘Prdm12阳性细胞谱（红色）。在配置文件"1"和"2"中也检测到Cck1r的中等信号。配置文件"3"代表Ccck1r或Ghsr的Prdm12细胞阴性。在C中，Ghsr信号（黄色）在代表性配置文件"4"中可以看到，但在"5"中看不到。（D） 饼图总结了共同表达 Ghsr（黄色）、Cck1r（青色）或两者（灰色）的 Prdm12 细胞（红色）的百分比估计值。计数轮廓的总数显示在图表旁边（n = 4个不同的神经节，左右组合）。每一方的结果都被合并，因为没有注意到差异。比例尺 = 158 μm （A） 和 15 μm （B， C）。缩写： DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NG = 结节神经节;JG = 颈神经节;ISH =原位杂交;Prdm12 = PR结构域锌指蛋白12;Phox2b = 成对的寄存器 2b;Ghsr = ghrelin受体;Cck1r =胆囊收缩素受体。请点击此处查看此图的放大版本。
| 蛋白石 | 激光线 | 检测范围 | 权力 | 获得 | 线平均值 | 像素大小 |
| 蛋白石 690 | 氦绥 633 nm | 668-696海里 | 2 | 724 | 4 | 约1024 x 1024 |
| 蛋白石 570 | DPSS 激光 561 nm | 579-627海里 | 15 | 450 | 4 | 约1024 x 1024 |
| 蛋白石 520 | 氩激光 488 nm | 499-535纳米 | 6 | 830 | 4 | 约1024 x 1024 |
| 达皮 | 二极管激光器 405 | 415-502纳米 | 12 | 532 | 4 | 约1024 x 1024 |
表 1：采集参数。 缩写：DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。
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Discussion
ISH的技术是在20世纪60年代后期发明的42。然而，直到20世纪80年代中期，它才被应用于中枢和周围神经系统中mRNA的检测43，44。考虑到神经系统的异质性和抗体反复出现的问题，在细胞水平上定位特定的转录本仍然是一个非常宝贵的工具。尽管如此，传统的ISH方法仍然费力且异常敏感。幸运的是，这项研究采用了一种称为RNAscope的高灵敏度ISH程序，该程序通常不会产生背景，并允许检测在低水平45，46表达的几个转录本。具体而言，多重荧光RNAScope用于同时检测Ghsr和Cck1r转录本。转录因子Phox2b和Prdm12进一步用作选择性标记，分别区分结节和颈静脉传入神经元。如果不可视化Phox2b和Prdm12，就很难确定地识别颈静脉与结核传入神经元。如上所述，一个关键步骤包括一致且适当的解剖技术。此外，内源性荧光的验证也是一个重要因素，因为它很容易被误认为是RNAScope信号。此外，强烈建议根据阴性对照组织选择适当的采集参数。如前所述，共聚焦显微镜是具有20倍和63倍（油）物镜的首选成像方法，因为1）在低水平和/或稀疏细胞中表达的转录本可能仅在高放大倍率下可见。2）共聚焦显微镜允许收集单个焦平面，考虑到当通过落射成像时，彼此重叠的两个细胞可能错误地显示为一个细胞，这一点很重要。3）共聚焦显微镜还允许更具选择性和灵活性的采集参数。上述采集参数仅作为示例提供，建议根据一种仪器进行修改，放大倍率（20x或63x），表达水平和任何给定组织的内源性荧光水平。染色程序本身仍然非常接近推荐方案，只需稍作调整。显然，这里描述的协议可以应用于检测任何转录本，而不仅仅是GPCR。尽管如此，考虑到针对GPCR24的抗体反复出现的问题，这里描述的程序特别有用。
如前所述15，小鼠结节有时通过细胞桥附着在颈上神经节上。该细胞桥的包含可能导致混淆的结果，例如，在结节神经节中检测到非迷走神经标志物。研究者可能希望系统地验证在夹层过程中，结节是否附着在颈上神经节上。否则，神经节之间不一致的解剖技能将引入实验变异性。同样重要的是要注意，岩和结核传入神经元都表达Phox2b47。因此，我们所说的结核传入神经元包括岩溶性和结核神经元。最后，在比较不同的研究时，应该记住，不同的安乐死方法会导致基因表达的变化48。
从理论上讲，用于检测的荧光团可以互换地归因于任何通道。然而，蛋白石 690 被发现会发出低水平的绿色荧光。在大多数情况下，在高度表达的转录本（例如Prdm12）的情况下，如果激光强度过高，则会看到不需要的绿色荧光。因此，Opal 690 推荐用于具有中/低表达的基因。如果仅使用高表达基因，建议进一步稀释 Opal 690（即 1/3，000），并且在图像采集过程中不要捕获非特异性的绿色荧光。RNAscope信号是不同颜色的单独点，即使转录本在同一细胞谱内表达也是如此。然而，对于高度表达的转录本，可能无法看到单个点，而是荧光填充细胞质。当点发出不同颜色的荧光时，人们可能会考虑由于采集参数不足和/或内源性色素等原因而导致的非特异性荧光问题。最后，Opal 570 和 620 不得同时使用，因为它们的发射光谱重叠。
如果没有观察到已知在目标组织中表达的基因的RNAscope信号，建议通过运行阳性探针（即肽基 - 脯氨酰顺式异构酶B管家基因）来验证组织的完整性。DAPI复染也有助于确定组织质量。DAPI标记的细胞核似乎被切碎，可能表明消化过度或组织固定不当。
结果，Ghsr在Prdm12阳性颈静脉传入神经元的一小部分中表达。相比之下，与之前的一项研究11一致，Ghsr mRNA在结核传入神经元中几乎不存在。据推断，qPCR和ISH先前检测到的Ghsr mRNA水平低可能是由于颈静脉传入神经元30，31，32。一项先前的钙信号传导研究表明，3%的培养迷走神经传入神经元对ghrelin49有反应，这个数字与表达Ghsr的颈静脉传入神经元的百分比非常相似。Cck1r在许多Phox2b阳性的结节传入神经元中表达，更令人惊讶的是，在Prdm12阳性颈静脉传入神经元的子集中表达。综上所述，本文证明了现有ISH技术的成功适应，以评估整个颈静脉结节性团中所选GPCR的细胞分布。
总之，采用多重ISH检测并同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合物中两个GPCR（Cck1r和Ghsr）和一个转录因子（Phox2b或Prdm12）的转录本。这里描述的方案可以成为RNA测序，qPCR和传统组织学的补充工具。然而，该协议可应用于其它类似大小的神经节。如上所述，采集参数、动物年龄和解剖的一致性是实验设计过程中需要考虑的重要因素。因此，它可以提供有关高度异质和小神经节中的地形基因表达模式的独特信息。该协议可用于在各种生理和病理生理条件的背景下确定颈静脉与结节传入神经元转录谱的变化，包括但不限于喂养状态的变化。它也可用于比较临床前研究中常用的动物物种中迷走神经传入神经元的神经化学组成，包括灵长类动物和猪50，51。
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Disclosures
作者声明没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了神经解剖学/组织学/脑注射核心的支持，由NIH资助#5P01DK119130-02资助。作者要感谢UT西南活细胞成像设施（由Phelps博士领导）及其工作人员（Abhijit Bugde和Marcel Mettlen）的帮助，部分由NIH Grant #1S10OD021684-01支持，这是Harold C. Simmons癌症中心的共享资源，部分由NCI癌症中心支持资助， P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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