Summary
Dit protocol beschrijft de dissectieprocedure, kweekconditie en live beeldvorming van een antenne-hersenexplantatiesysteem voor de studie van de olfactorische circuitassemblage.
Abstract
Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de juiste functie van de hersenen. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien 50 soorten olfactorische receptorneuronen (ORN's) van de antennes en maxillaire palpen hun axonen projecteren op 50 identificeerbare glomeruli in de antennekwab en synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR's). Eerdere studies richtten zich vooral op het identificeren van belangrijke moleculen die de precieze targeting in het olfactorische circuit reguleren met behulp van vaste weefsels. Hier wordt een antenne-hersenexplantatiesysteem beschreven dat belangrijke ontwikkelingsmijlpalen van olfactorische circuitassemblage in cultuur samenvat. Door de externe cuticula te ontleden en ondoorzichtige vetlichamen te reinigen die het zich ontwikkelende popbrein bedekken, kunnen hoogwaardige beelden van afzonderlijke neuronen uit levende hersenen worden verzameld met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Dit maakt time-lapse beeldvorming mogelijk van enkele ORN axon targeting uit levend weefsel. Deze aanpak zal helpen bij het onthullen van belangrijke celbiologische contexten en functies van eerder geïdentificeerde belangrijke genen en het identificeren van mechanismen die ten grondslag liggen aan het dynamische proces van circuitassemblage.
Introduction
Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de goede werking van de hersenen. Al meer dan 100 jaar proberen neurowetenschappers met extreme precisie te begrijpen hoe neurieten zich uitstrekken naar hun tussen- en einddoelen. Als gevolg hiervan hebben ze belangrijke genen geïdentificeerd die coderen voor aanwijzingen voor het ontwikkelen van neuronale processen1. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien olfactorische receptorneuronen (ORN's, de primaire sensorische neuronen) projecteren op 50 identificeerbare glomeruli met stereotiepe grootte, vorm en relatieve positie, waar ze synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR's), die elk dendrieten naar een van de 50 glomeruli2 sturen (figuur 1A ). Daarom is het relatief eenvoudig om gemuteerde fenotypen te identificeren bij synaptische (glomerulaire) resolutie in het reuksysteem van de vlieg. Dit leidde tot ontdekkingen van belangrijke genen die de assemblage van olfactorische circuitsreguleren 3.
De assemblage van het reukcircuit van de vlieg is afhankelijk van temporeel en ruimtelijk gecoördineerde ontwikkelingsprocessen3. ORN's en PN's krijgen verschillende celbestemmingen, die het programma opzetten voor hun bedradingsspecifieke kenmerken. Vervolgens prepatriëren PN-dendrieten de antennekwab (figuur 1B). De axonen van ORN's omcirkelen vervolgens de ipsilaterale antennekwab en kruisen de middellijn van de hersenen om de contralaterale antennekwab te bereiken. Vervolgens dringen ORN-axonen zowel ipsi- als contralaterale antennelobben binnen en vormen synapsen met dendrieten van hun partner-PR's in specifieke glomeruli. Dit grove model voor olfactorische circuitassemblage werd voorgesteld op basis van de karakterisering van vaste monsters uit tussenliggende tijdspunten tijdens de ontwikkeling. De slechte temporele resolutie en het onvermogen om dezelfde neuronale processen te volgen tijdens de ontwikkeling van vast weefsel beperken het mechanistische begrip van het circuitassemblageproces.
Het is technisch een uitdaging om ORN- en PN-processen in vivo te leven, omdat het bedradingsproces plaatsvindt in de eerste helft van het popstadium wanneer de antennekwab wordt omringd door ondoorzichtig vetlichaam in de pop. Het is daarom onmogelijk om het zich ontwikkelende reukcircuit van intacte poppen direct in beeld te brengen. Ontleedde weefsels die ex vivo zijn gekweekt, kunnen weefselopaciteit omzeilen en zijn met succes gebruikt om de neurale ontwikkeling tebestuderen 4,5,6. De uitdaging van het gebruik van een vergelijkbare ex vivo explantcultuurstrategie om neuronale bedrading in het popbrein te bestuderen, is of het de precieze neurontargeting in een cultuurconditie samenvat. Op basis van een eerder gerapporteerde ex vivo kweekconditie voor het fly eye-brain complex7, is onlangs een explant ontwikkeld die het hele popbrein, antennes en de verbindende antennezenuwen intact bevat, die nauwkeurige targeting van het reukcircuit behoudt en kan worden onderworpen aan op twee fotonenmicroscopie gebaseerde live beeldvorming tot 24 uur met de frequentie van elke 20 min8 . Hier wordt een gedetailleerd protocol van de explantcultuur en beeldvorming beschreven. Het explantingsysteem biedt een krachtige methode om de assemblage van olfactorische circuits en mogelijk andere circuits in de centrale hersenen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Alle stappen in dit protocol worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 °C), tenzij anders uitgelegd.
- Om de kweekschaal klaar te maken voor het immobiliseren van de explant tijdens timelapse-beeldvorming, legt u 0,5 cm dikke Sylgard (meng twee vloeibare componenten grondig in 10: 1-verhouding vóór gebruik) op het bodemoppervlak van een petrischaal van 60 mm x 15 mm en laat u deze 48 uur uitharden bij kamertemperatuur (figuur 2A, in de volgende tekst Sylgard-plaat genoemd).
- Om micropennen voor te bereiden voor het immobiliseren van explant op deze plaat, gebruikt u een tang om meerdere micropennen op een tape te plakken met de scherpe uiteinden aan één kant uitgelijnd (figuur 2B). Gebruik een schaar om ~2 mm van de scherpe uiteinden van de micropennen te knippen (figuur 2B'). Gebruik een tang om de gesneden micropennen vast te houden en steek in de Sylgard-laag van een vooraf gemaakte Sylgard-plaat (figuur 2C). Twee micropennen worden gebruikt om één explant te immobiliseren.
- Gebruik een borstel om witte poppen te verzamelen, die binnen 1 uur puparium vormen, van hsFLP, pebbled-GAL4 / +; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genotype en breng ze over naar nieuwe injectieflacons. Hitteschok in een waterbad van 37 °C gedurende 40 minuten om schaarse ORN-klonen van willekeurige typen te induceren. Plaats de injectieflacons na een hitteschok gedurende 30 uur op 25 °C, wat resulteert in poppen die na pupariumvorming (APF) op 30 uur oud zijn.
- Om het kweekmedium voor explanting voor te bereiden, voegt u 5 ml Penicilline-Streptomycine (10.000 E / ml) toe aan 500 ml Drosophila Medium van Schneider. Filtreer het medium en maak 45 ml aliquots in conische buizen van 50 ml. Het medium kan 1-2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Neem op de dag van beeldvorming één buis van 45 ml Drosophila-medium van Schneider en voeg 5 ml foetaal runderserum (10% v /v), 125 μl 4 mg / ml humane insulinevoorraadoplossing (10 μg / ml eindconcentratie), 50 μl 1 mg / ml 20-hydroxyecdysonvoorraadoplossing opgelost in ethanol (1 μg / ml eindconcentratie). Meng goed en breng 15 ml volledig medium over in een nieuwe conische buis van 50 ml. De rest van het volledige medium kan een week lang bij 4 °C worden bewaard. Foetaal runderserum, humane insulinestockoplossing en 20-hydroxyecdyson-stamoplossing worden gealiquoteerd en bewaard bij -20 °C.
- Oxygeneer het 15 ml volledige medium door zuurstofbellen uit een zuurstofcilinder onder het vloeistofoppervlak door een steriele pipetpunt van 5 ml te pompen met een snelheid van één bel / s gedurende 20-30 minuten. Gebruik een paraffinefilm om de opening van de buis tijdens dit proces te bedekken.
- Steriliseer het oppervlak van de dissectieput en de Sylgard-plaat (met micropennen op de Sylgard-laag, bereid in stappen A1 en A2) met 70% ethanol. Laat ze drogen voor gebruik.
2. Ontleding van de uitplant
- Gebruik een borstel om 30 h APF (30 h na pupariumvorming) poppen over te brengen naar een papieren zakdoekje en droog het buitenoppervlak van de poppen gedurende 5 minuten.
- Leg een stuk dubbelzijdige tape op een glasplaat. Bevestig de gedroogde poppen voorzichtig op het kleverige oppervlak van de tape met de dorsale kant naar boven gericht. Druk voorzichtig met een borstel op de poppen om de ventrale kant van de poppen goed aan de tape te laten hechten (figuur 3A). Beschadig de pop niet.
- Gebruik een tang om de bruine popbehuizing te verwijderen die de dorsale kant van het hoofd bedekt (figuur 3A, B). Steek een scherpe punt van de tang tussen de bruine pop en de pop vanaf de zijkant en breek de bruine popbuis voorzichtig door een lijn naar het achterste uiteinde van de pop (figuur 3B,C). Open de bruine poppoule. Gebruik een tang om de pop voorzichtig vast te houden en breng over naar de dissectie goed met 1 ml zuurstofrijk vol medium. Dompel drijvende pop onder op het medium oppervlak om het naar de bodem van de put te laten zinken (figuur 3D).
OPMERKING: Steek de tangpunt niet te diep in de bruine pop om te voorkomen dat de pop met de tang gewond raakt. - Om de antenne-hersenen explant van de pop te ontleden, gebruikt u een tang om de pop voorzichtig met één hand vast te houden en gebruikt u een paar microscisors om met de andere hand een klein gaatje van de achterste kant van de pop te snijden (figuur 3E). Dit kleine gaatje laat de hoge druk in de pop los.
- Snijd de ventrale middellijn van de pop door van het gat tot aan de nek (de smalle structuur die het hoofd en de thorax verbindt) met de microscisors (figuur 3F). Snijd vervolgens door de omtrek van de nek om het hoofd los te maken van het lichaam van de pop (figuur 3G). Verwijder het lichaam en plaats het in een andere put.
OPMERKING: Snijd de nek niet rechtstreeks van de dorsale / ventrale kant van de pop, die de hersenen kan knijpen. - Snijd de transparante cuticula die de dorsale kant van de hersenen bedekt (figuur 3H). Dit zal het vetlichaam bovenop de hersenen blootleggen. Houd een nagelriem aan waaraan het netvlies en de antennes hechten. Herhaal dezelfde procedure naar de ventrale kant van de hersenen.
OPMERKING: Steek het mes van de schaar niet te diep onder de nagelriem, omdat dit zal leiden tot het doorsnijden van de antennezenuwen die de antennes en de hersenen verbinden (figuur 3H'). - Gebruik een P10-pipet om het vetlichaam dat de hersenen en antennes bedekt voorzichtig uit te wassen door het medium naar de open gebieden aan de dorsale en ventrale zijden van het hoofd te pipetteren (figuur 3I).
OPMERKING: Wees heel voorzichtig bij het pipetteren van het medium, omdat de hersenen gemakkelijk van de nagelriem kunnen worden losgemaakt. Zorg ervoor dat al het vetlichaam tijdens deze stap wordt verwijderd. De gestileerde ontwikkeling van ORN-axonen werd waargenomen wanneer het vetlichaam niet goed werd gereinigd, waarschijnlijk als gevolg van slechte zuurstoftoegang vanuit het medium. - Om de interactie van bilaterale ORN-axonen of ORN-axonen met PN-dendriet-targeting te bestuderen, snijdt u een of twee antennezenuwen met de microscisors tijdens deze fase8 (figuur 3J). Plaats voorzichtig de messen van de schaar tussen de nagelriem en de hersenen en snijd geïnteresseerde antennezenuwen af.
- Om de ontlede explant over te brengen naar de Sylgard-plaat, plaatst u een druppel zuurstofrijk vol medium (~ 200 μL) op het Sylgard-oppervlak. Bedek het binnenoppervlak van een 200 μL brede tippipetpunt met het vetlichaam uit de ontlede stam (stap 1.6) door het vetlichaam meerdere keren te pipetteren, zodat de explantaten de pipetpunt niet kunnen plakken tijdens het overbrengen. Gebruik vervolgens deze pipetpunt met brede punt om de explant van de dissectieput over te brengen naar de medium druppel op de kweekplaat (figuur 3K).
- Gebruik een tang om de explant vast te pinnen op de Sylgard-laag in de twee optische lobben (figuur 3L). Plaats de Sylgard-plaat voorzichtig op het beeldvormingsstation en immobiliseer de plaat met tapes. Voeg langzaam 10 ml zuurstofrijk volledig medium toe aan de Sylgard-plaat met behulp van de P1000-pipet.
OPMERKING: Verstoor de explant niet wanneer u het medium aan de Sylgard-plaat toevoegt.
3. Op twee fotonenmicroscopie gebaseerde live beeldvorming
- Om time-lapse beeldvorming uit te voeren, gebruikt u een microscoop met twee fotonen, een Ti: Sapphire-laser, een 20x wateronderdompelingsobjectief (1,0 NA) en een beeldvormingssoftware. Gebruik de excitatiegolflengte bij 920 nm voor het afbeelden van GFP-eiwitten. Pas de pixelverblijftijd aan op 10 μs.
- Pas de positie van het beeldvormingsstation aan zodat de explantaten ongeveer onder het doel liggen. Gebruik 70% ethanol om de lens te steriliseren voordat u een beeld afbeeldt. Verlaag langzaam het doel onder het medium dicht bij de explants. Controleer of er een bubbel op de lens van het objectief zit.
- Til dan het objectief boven het medium en herhaal dit totdat de bubbel weg is. Zoek de explants met behulp van het oculair en centreer één explant in het veld.
- Om een explanting te garanderen met een paar ORN's die schaars zijn gelabeld voor timelapse-beeldvorming, ontleedt u elke keer ~ 10 explants en lijnt u uit op de y-as op de kweekplaat. Scherm alle explantaties door het objectief langs de y-as te bewegen en kies een explant waarbij enkele enkele ORN-axonen net de antennekwab hebben bereikt voor beeldvorming (figuur 4A).
- Herken de antennekwab aan zijn ovale vorm en de ORN-axonen die eromheen beginnen te cirkelen. Stel een gebied van ~150 μm x 150 μm in het xy-vlak in (3x zoom met het 20x objectief). Schat de grens van de twee antennelobben en centreer ze in het beeldvormingsgebied.
- Selecteer een eerste beeldgebied langs de z-as door het onderste gedeelte en het bovenste gedeelte van het scannen te definiëren. Stel het beeldgebied in langs de z-as. Stel het diepste gedeelte in met ORN axonsignalen als de eerste beeldvormingssessie en de sessie 100 μm hierboven (meer oppervlakkige kant) als de laatste beeldvormingssessie (figuur 4B).
OPMERKING: Dit laat sommige secties aan de bovenkant (oppervlakkige kant) van de ORN-axonen en voorkomt verschuiving van ORN-axonen naar boven buiten het beeldvormingsgebied als gevolg van de groei van de hersenen tijdens de kweek.- Beeld met intervallen van 2 μm. Stel automatische beeldscanning in op de frequentie van elke 20 minuten met behulp van beeldbewerkingssoftware.
- Verschuif het beeldvormingsgebied 20 μm omhoog langs de z-as na de eerste 4 uur-beeldvorming en nog eens 20 μm omhoog langs de z-as na 16 uur beeldvorming. Dit kan worden bereikt door een script en verschillende z-stacks in de imaging-software in te stellen.
- Kweek de explant gedurende een extra periode na beeldvorming (tot 24 uur ex vivo) vóór fixatie en kleuring met N-cadherine, een neuropilmarker, om de genetische identiteit van elke afzonderlijke ORN te onthullen door de glomerulus waarop het zich richt.
4. Beeldverwerking
- Om z-stackafbeeldingen uit sectiereeksen te verwerken die op elk tijdstip zijn genomen met behulp van de Fiji-software, opent u de afbeeldingssectieserie, klikt u op Afbeelding | Stapels | Z-project [/].
- Om laterale drift van het monster tijdens het kweken te corrigeren, installeert u TurboReg Plugin in Fiji.
- Open een z-stapelafbeeldingsreeks en een enkele z-stapelafbeelding uit de reeks. Plug-ins | openen Registratie | TurboReg.
- Selecteer de reeks z-stackafbeeldingen in Bron en de enkele z-stackafbeelding in Doel| Vertaling. Klik op de batchknop om alle afbeeldingen uit de geopende z stack-afbeeldingsreeks te registreren.
- Om het nut van afbeeldingsvoorbeelden te maximaliseren, scheidt u schaars gelabelde enkele axonen in de buurt van elkaar van de z-stapelafbeeldingen na 3D-afbeeldingssecties.
- Om enkele ORN-axonen uit een paar axonen in dezelfde afbeelding te extraheren, opent u de afbeeldingssectiereeks, klikt u op Plug-ins | Segmentatie | Segmentatie-editor [/]. Selecteer het penseelgereedschap en maskeer geïnteresseerd ORN axon in het werkvenster van de segmentatie-editor met de knoppen "+" of "-" selecteren in elke afbeeldingssectie.
- Klik op proces| Beeldcalculator [/]. Selecteer "Afbeelding X" in Afbeelding 1, "Vermenigvuldigen" in Werking, "Afbeelding X. labels" in Afbeelding 2, [/]. Dit genereert een nieuw afbeeldingsreeksbestand met alleen het geïnteresseerde axon. Voer stap 4.1 uit om de z-stackafbeelding te verwerken. Herhaal deze stap voor alle tijdspunten om een tijdreeksafbeeldingsbestand te genereren.
- Als u verschillende axonen uit dezelfde afbeelding pseudokleur wilt maken, voert u eerst stap 4.3 uit om het tijdreeksafbeeldingsbestand van elk axon afzonderlijk te genereren. Open de tijdreeksafbeeldingsbestanden voor verschillende afzonderlijke axonen uit dezelfde onbewerkte gegevensafbeelding. Klik op Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen. Selecteer verschillende tijdreeksafbeeldingsbestanden in verschillende kleurkanalen en klik op OK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ORN-axonen komen tussen 18 h en 36 h APF bij de antennele lob. Ze navigeren dan door de antennekwab, steken de middellijn over en innerveren de glomeruli. Video 1 is een representatieve video die het hele proces toont voor verschillende individueel identificeerbare axonen, genomen met de frequentie van elke 20 minuten gedurende 24 uur. Voordat de registratie met TurboReg wordt gebruikt, vertonen de axonen enige laterale drifting naarmate de hersenen zich ontwikkelen (eerste helft van de video). Na registratie wordt het driften gecorrigeerd (tweede helft van de video).
Om enkele ORN-axonen van dezelfde explant te scheiden, is één voorbeeld weergegeven in figuur 5. Volgens de procedure in stap 4.3 werden VA1d- en VA1v-axonen uit explant in figuur 5A geëxtraheerd om een nieuw z-stackbeeld te genereren met alleen deze twee axonen (figuur 5B). Evenzo werden VM2- en VM3-axonen (figuur 5B') en DL2-axon (figuur 5B'') geëxtraheerd. Figuur 5C toont een samenvoeging van afbeeldingen in figuur 5B-B'' met pseudokleuren. De genetische identiteiten van elk ORN-axon werden onthuld door immunostaining van een neuropilmarker N-cadherine van de vaste explant (figuur 5D,E).
Figuur 1: Structuur van het reukcircuit van de vlieg. (A) Een volwassen vliegenkop wordt getoond met één ORN van de rechterantenne (groen) die zijn axon naar beide antennelobben (AN) in de hersenen stuurt en synaptische verbinding vormt in een specifieke glomerulus met dendrieten van PNs (rood) in de ipsilaterale en contralaterale AN. Onderbroken verticale lijn geeft de middellijn aan in deze en volgende diagrammen en afbeeldingen. (B) Diagram met de ontwikkeling van het reukcircuit. (1) PN-dendrieten innerveren eerst een gebied in de antennekwab (rood). ORN-axonen bereiken de antennelobben in de hersenen. (2) ORN-axonen nemen een dorsolateraal (groen) of ventromediaal (blauw) traject om de antennekwab te omcirkelen. (3) ORN axonen passeren de middellijn. (4) ORN axonen innerveren glomeruli in de antennekwab. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding van de beeldvormingskamer voor de explant. (A) Leg een laag siliconenelastomeer (~ 0,5 cm) op de bodem van een petrischaaltje van 60 mm. (B-B') Lijn de pinnen uit op een tape en knip ze tot ~ 2 mm lang met een schaar. (C) Speld de micropennen op de siliconenelastomeerlaag van de kweekplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De dissectieprocedure voor de antenne-hersenexplant. (A) Bevestig de ventrale kant van een met papieren zakdoekjes gedroogde pop op een dubbelzijdige tape op een glasplaat. (B-C) Gebruik een tang om de externe bruine nagelriem te snijden om de pop binnenin bloot te leggen. (D) Breng de pop over naar een dissectieput met zuurstofrijk vol medium. (E-G) Scheid de popstam zorgvuldig van het hoofd met behulp van microscissors. (H) Snijd de stukjes semitransparante cuticula die de dorsale en ventrale zijden van de hersenen bedekken. Houd wat nagelriem aan de voorste en laterale zijden van de hersenen om verbindingen tussen het netvlies, de antennes en de hersenen te behouden. (H') Vermijd het doorsnijden van de antennezenuw tijdens deze stap. (I) Reinig het vetlichaam dat de hersenen bedekt door voorzichtig te pipetteren. (J) Breek een of twee antennezenuw (en) met behulp van microscisors in bepaalde experimenten. (K) Plaats een druppel zuurstofrijk vol medium op het oppervlak van de kweekplaat. Breng de ontlede explant over met een pipetpunt met brede punt. (L) Gebruik een tang om de twee optische lobben van de explant op de siliconenelastomeerlaag te pinnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Time-lapse beeldvorming van enkele ORN-axontargeting vanuit een explant. (A) Selecteer een explant met een paar ORN-axonen die net de antennekwab bereiken. Schat de vorm van twee antennelobben door de kromming van de axonen en centreer de antennelobben in het beeldvormingsveld. (B) Stel het beeldgebied in langs de z-as. Bedenk dat de antennekwab naar boven zal verschuiven naarmate de hersenen groeien en zich ontwikkelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Extraheer enkele ORN's en onthul hun glomerulaire identiteit. (A) Een maximaal projectiebeeld van een explant met 5-10 enkele ORN-axonen met behulp van twee-fotonmicroscopie met 20x objectief en 3x inzoomen. (B-B'') 1-2 enkele axonen worden geëxtraheerd uit (A) door handmatig maskers in beeldsecties te maken van de onbewerkte beeldgegevens. (C) Voeg de afbeeldingen van (B-B'') met elk axon pseudo-gekleurd anders samen. (D-D') Maximale projectie confocale beelden gemaakt met 40x objectief en 1,5x zoom. Explant getoond in (A) werd gefixeerd gevolgd door kleuring met anti-GFP en anti-N-cadherine (neuropil marker). Voorste en achterste helften van de antennelobben zijn stapels afzonderlijk in (D) en (D'). (E) Antennekwabkaart toont geëxtraheerde ORN-axonen in (B,C). Sommige afbeeldingen in deze figuur zijn aangepast van een eerdere studie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Op twee fotonenmicroscopie gebaseerde time-lapse-beelden tonen targeting van twee ORN-axonen, voor en na beeldregistratie. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Drosophila antenne-hersen explant behoudt normale targeting van het reukcircuit. We merkten wel dat de ontwikkeling ex vivo 2 keer langzamer gaat dan in vivo. Opgemerkt wordt dat het explant-systeem geen maxillaire palp behoudt, die zes soorten ORN's herbergt. Om ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling ex vivo wordt samengevat, moet het uitrekken van de antennezenuwen worden vermeden tijdens explantdissectie. Tijdens ex vivo kweek veroorzaakt bacteriegroei meestal een gestopte ontwikkeling van het reukcircuit. Daarom is een grondige sterilisatie van de kweekschaal en pinnen vóór beeldvorming en het schoon en geïsoleerd houden van de beeldvormingsruimte belangrijk.
Deze explant ondersteunt langdurige twee-fotonen microscopie gebaseerde time-lapse beeldvorming. In combinatie met een nieuw ontwikkelde reporter voor schaarse etikettering van enkele ORN's, maakt het explant-systeem beeldvorming met hoge resolutie mogelijk vanaf één axon-eindpunt. Dit systeem is krachtig om de celbiologische mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan het dynamische proces van olfactorische circuitassemblage8. Hoewel de ontwikkeling van olfactorische circuits hier als voorbeeld werd getoond, kan dit systeem mogelijk worden uitgebreid naar studies van andere circuits of andere ontwikkelingsprocessen in de zich ontwikkelende centrale hersenen.
De explant handhaaft de normale ontwikkeling in cultuur gedurende ten minste 24 uur, wat het hele proces van ORN-targeting kan vastleggen. Het stelt onderzoekers in staat om de genetische identiteit van enkele ORN-axonen te onthullen door middel van tegenkleuring met een neuropilmarker na fixatie, omdat de antennekwab al een duidelijke glomerulaire structuur ontwikkelt aan het einde van de cultuur. Deze strategie omzeilt het probleem van het ontbreken van specifieke genetische drivers voor veel ORN-typen in een vroeg ontwikkelingsstadium om beeldvorming van specifieke soorten ORN's te bereiken met behulp van een pan-ORN-driver.
Om een hogere spatiotemporale resolutie te bereiken, kan dit explantsysteem in beeld worden gebracht met behulp van meer geavanceerde microscopie, de adaptieve optica-rooster lichtplaatmicroscopie (AO-LLSM). Het is aangetoond dat de AO-LLSM visualisatie van fijne structuren van axonterminals en scanfrequentie mogelijk maakt bij elke 30 seconden per volume 8,9,10,11. Een voordeel van de explant is de compatibiliteit met Janelia Fluorophore dye 12,13,14 labeling door het incuberen van de explanting die Halo-tag tot expressie brengt in specifieke neuronen met kleurstoffen in het medium voordat beeldvorming plaatsvindt. Het viel op dat het incuberen van de explant met kleurstofbevattend medium resulteert in een veel sterkere etikettering dan het voeden van de larven met de kleurstof. Dit unieke voordeel stelde ons in staat om axonen in een vroeg ontwikkelingsstadium in beeld te brengen dat nauwelijks werd gevisualiseerd door GFP-labeling8.
Naast time-lapse beeldvorming heeft het explantsysteem nog andere voordelen. Zo is het mogelijk om antennezenuwen eenzijdig of bilateraal van de ontlede explant af te snijden op specifieke ontwikkelingstijdpunten (stap 2.8). Dit stelt onderzoekers in staat om de vereiste van ORN-axonen te onderzoeken bij het richten van alle neurontypen in het olfactorische circuit bij verschillende ontwikkelingsstappen. In het bijzonder unilaterale antenne zenuwafbrekende assays, die niet kunnen worden bereikt door traditionele genetische manipulatie, leidden tot een interessante ontdekking dat interactie tussen bilaterale ORN-axonen vereist is voor een correcte contralaterale targeting van ORN-axonen8. Bovendien wordt de explant direct in medium gekweekt in plaats van te worden ingebed in agarose, waardoor een snelle afgifte en uitwassen van sommige kleine moleculen of geneesmiddelen mogelijk is. In vergelijking met genetische manipulatie heeft medicamenteuze behandeling de voordelen van een snel effect en omkeerbaarheid van de manipulatie. Het stelt onderzoekers in staat om enkele essentiële processen voor cellen in latere ontwikkelingsstadia te beoordelen door celletaliteit of ongezonde problemen als gevolg van constitutieve verstoring door genetische manipulaties te omzeilen. Het helpt ook bij het visualiseren van subtiele veranderingen door te vergelijken voor en na medicamenteuze behandeling en na het uitwassen van drugs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken N. Özel en R. Hiesinger voor hun advies over de explantcultuur; M. Wagner voor technische hulp van de twee-fotonenmicroscopie; D.J. Luginbuhl voor het genereren van transgene vliegen; D. Friedmann voor suggesties van Fiji software analyse; Y. Ge voor hulp bij vliegwerk; C. McLaughlin en K.K.L. Wong voor commentaar op het manuscript. L.L. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd ondersteund door national institutes of health grants 1K99DC01883001 (aan T.L.) en R01-DC005982 (aan L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
