Summary
Detta neurala celldissociationsprotokoll är avsett för prover med en låg mängd utgångsmaterial och ger en mycket livskraftig encellssuspension för nedströms analys, med valfria fixerings- och färgningssteg.
Abstract
Detta neurala dissociationsprotokoll (en anpassning av protokollet som åtföljer ett kommersiellt dissociationspaket för vuxna hjärnor) optimerar vävnadsbehandling som förberedelse för detaljerad nedströmsanalys såsom flödescytometri eller encellssekvensering. Neural dissociation kan utföras via mekanisk dissociation (såsom användning av filter, huggningstekniker eller pipetttriturering), enzymatisk matsmältning eller en kombination av dessa. Den känsliga naturen hos neuronala celler kan komplicera ansträngningarna för att erhålla den mycket livskraftiga, sanna encellssuspensionen med minimalt cellulärt skräp som krävs för encellsanalys. Data visar att denna kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning konsekvent ger en mycket livskraftig (>90%) encellssuspension, vilket övervinner de ovan nämnda svårigheterna. Medan några av stegen kräver manuell fingerfärdighet, minskar dessa steg provhantering och potentiell cellförlust. Detta manuskript beskriver varje steg i processen för att utrusta andra laboratorier för att framgångsrikt dissociera små mängder neural vävnad som förberedelse för nedströms analys.
Introduction
Hippocampus beskrevs först av en bolognesisk anatom, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-talet1. Vid namngivningen av denna nyfunna struktur inspirerades Aranzio troligen av dess kusliga likhet med sjöhästen i släktet Hippocampus1. Hippocampus är involverad i stressreaktioner men är allmänt känd för sin roll i lärande och minne. Mer specifikt är hippocampus ansvarig för kodning och hämtning av deklarativt och rumsligt minne1.
Hippocampus, eller hippocampus korrekt, är uppdelad i CA1 (cornu ammonis), CA2 och CA3 delfält1. Jämfört med resten av nervsystemet har hippocampus flera unika definierande egenskaper, inklusive dess plasticitet och potential för pågående neurogenes2. Neurogenes är processen för spridning och differentiering av neurala stamceller, följt av deras integration i det befintliga neuronala nätverket. Neurogenes är begränsad till den subgranulära zonen i dentate gyrus och subventrikulär zon i laterala ventriklar (och luktlökarna)3. Medan neurogenes är riklig i embryogenes, är det en livslång process 3,4. Som sådan kommer denna diskussion att fokusera på vuxen neurogenes i hippocampus.
De subventrikulära och subgranulära zonerna är neurogena nischer som innehåller ependymala och vaskulära celler, liksom omogna och mogna linjer av neurala stamceller5. Microglia bidrar till dessa nischer som immunceller för att reglera neurogenes6. Neurala stamceller är icke-stamcellsavkomma från neurala stamceller7. Tre typer av neurala förfäder finns i den subventrikulära zonen: radiella glialiknande typ B-celler, typ C transitförstärkande förfäder och typ A-neuroblaster 3,8. De långsamt delande typ B-neurala stamcellerna i den subventrikulära zonen kan differentieras till snabbt delande typ C-celler8. Därefter differentieras typ C-celler till typ A-celler8. Dessa neuroblaster migrerar genom rostral migrationsströmmen till luktlampan innan de differentieras till interneuroner eller oligodendrocyter9. Dessa olfaktoriska bulbinterneuroner är nyckeln till olfaktoriskt korttidsminne och associativt lärande, medan oligodendrocyterna myeliminerar axoner i corpus callosum9. Majoriteten av vuxen neurogenes förekommer i den subgranulära zonen i dentate gyrus, där radiella typ 1 och icke-radiella typ 2 neurala förfäder finns3. De flesta neurala stamceller är avsedda att bli dentatgranulneuroner och astrocyter10. Anslutna med gapkorsningar bildar astrocyter nätverk för att modulera plasticitet, synaptisk aktivitet och neuronal excitabilitet5. Som den primära excitatoriska neuronen i dentate gyrus ger granulatceller inmatning från entorhinal cortex till CA3-regionen11.
Neurala stamcellspopulationer kan isoleras med hjälp av immunomagnetiska eller immunofluorescerande isoleringsstrategier12,13. Neural vävnad är särskilt svår att dissociera; Ansträngningar att göra det resulterar ofta i prover med dålig cellviabilitet och / eller misslyckas med att producera den nödvändiga encellssuspensionen för nedströms analys. Neural dissociation kan utföras via mekanisk dissociation (såsom användning av filter, huggningstekniker eller pipetttriturering), enzymatisk matsmältning eller en kombination av tekniker 14,15. I en studie som utvärderade neurala dissociationsmetoder jämfördes livskraften och kvaliteten på manuell mekanisk dissociation genom pipetttriturering jämfört med kombinationer av pipetttriturering och matsmältning med olika enzymer15. Kvaliteten graderades baserat på mängden cellklumpar och DNA eller subcellulärt skräp i den beredda suspensionen15. Suspensioner av glialtumörer som utsattes för manuell mekanisk dissociation ensam hade signifikant lägre cellviabilitet än behandlingar med dispas eller en kombination av DNas, kollagenas och hyaluronidas15. Volovitz et al. erkände variationen i lönsamhet och kvalitet mellan de olika metoderna och betonade att otillräcklig dissociation kan minska noggrannheten i nedströmsanalys15.
I en separat studie jämförde författarna över 60 olika metoder och kombinationer av dissociation av odlade neuronala celler14. Dessa metoder inkluderade åtta olika variationer av manuell mekanisk dissociation genom pipetttriturering, en jämförelse av inkubation med fem individuella enzymer med tre olika intervall och olika kombinationer av mekanisk dissociation med enzymatisk matsmältning eller kombinationen av två enzymer14. Ingen av de mekaniska metoderna gav en encellig suspension14. Fyra av de enskilda enzymbehandlingarna, tio av de enzymatiska kombinationsbehandlingarna och fyra av kombinationerna av mekanisk dissociation med enzymatisk matsmältning gav en encellig suspension14. Enzymatisk matsmältning med TrypLE följt av Trypsin-EDTA mest effektivt dissocierade prover14. För övrigt tenderade prover behandlade med TrypLE och/eller Trypsin-EDTA att bilda gelatinösa klumpar14. Medan denna studie utfördes på odlade celler, talar den om bristerna i pipetttriturering eller enzymatisk matsmältning ensam.
Jämförelser sida vid sida av manuell kontra automatiserad mekanisk dissociation saknas. En grupp körde dock flödescytometri för att jämföra manuell och halvautomatiserad mekanisk dissociation av hela mushjärn i samband med kommersiella papain- eller trypsinenzymatiska dissociationssatser16. Bearbetning med dissociatorn gav mer konsekvent livskraftiga celler16. Efter dissociation isolerade författarna också Prominin-1-celler, neuronala prekursorceller och mikroglia16. För två av de tre isolerade cellpopulationerna var renheten hos de isolerade cellerna något högre när proverna bearbetades med dissociatorn, jämfört med manuellt16. Reiß et al. noterade att person-till-person-variation i pipetteringsteknik hindrar reproducerbarhet av livskraftigt cellpopulationsutbyte vid vävnadsdissociation16. Författarna drog slutsatsen att automatiserad mekanisk dissociation standardiserar provbearbetning16.
Metoden för dissociation som beskrivs i detta manuskript är en kombination av helautomatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning, med hjälp av lösningar som åtföljer ett kommersiellt dissociationspaket för vuxna hjärnor17. Till skillnad från standardprotokoll minskar detta optimerade protokoll provmanipulation, ger en mycket livskraftig encellssuspension och är avsedd för bearbetning av minimala mängder startvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes i enlighet med de etiska normer som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid UAMS. 6 månader gamla kvinnliga C57Bl6 / J vildmöss köptes och grupphuserades (4 möss per bur) under en konstant 12 h ljus / mörk cykel.
1. Beredning av reagenser
- Förbered fixbar levande / död fläcklösning. Rekonstituera den fluorescerande fläcken med 20 μL dimetylsulfoxid (DMSO).
- Förpacka flaskan i folie, märk den som "Rekonstituerad" och förvara den vid -20 °C i upp till sex månader.
- Förbered en 0,9% saltlösning med heparin. Späd innehållet i en injektionsflaska med heparinnatrium (10 000 USP-enheter per 10 ml) i 1 liter dubbeldestillerat vatten (ddH2O).
- Förbered tillräckligt för cirka 45 ml per djur och förvara vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Gör 1% paraformaldehyd (PFA).
- Värm en värmeplatta till 50 °C i en draghuv. Värm 100 ml ddH2 O i en mikrovågsugn till cirka60 °C. Tillsätt en magnetisk omrörningsstång och överför till kokplattan.
- Väg ut 1 g PFA i draghuven och tillsätt till bägaren avddH2O. Tillsätt 0,1125 g NaOH-kristaller och blanda tills det är upplöst (5-10 min).
- Tillsätt 0,4 g NaPO4- monobasisk och blanda tills den är upplöst (2-5 min). Vakuumfiltret lösningen och justera pH till 7,4 med HCl och NaOH.
- Kyl på is eller vid 4 °C i 30 min innan du förvarar.
OBS: Alikvoter på 1,5 ml kan lagras vid -20 ° C i ett år. Undvik frys-tina cykler. Om lösningen efter upptining blir grumlig eller en fällning har bildats, ska lösningen inte användas.
VARNING: Giftigt, brandfarligt. Arbeta alltid med PFA under en ventilerad huva med lämplig personlig skyddsutrustning.
- Resuspend lyofiliserat enzym A med 1 ml buffert A. Virvla inte lösningen.
OBS: Enzym A och buffert A samt buffertar A, Y och Z är reagenser i det kommersiella Adult Brain Dissociation Kit17. - Dela enzym P i alikvoter på 50 μL och resuspend enzym A i 10 μL alikvoter. Instruktioner per kit, förvara vid -20 °C i upp till sex månader. Undvik frys-tina cykler.
2. Experimentets dag
- Kyl bordsskivans centrifug till 4 °C.
- Placera alikvot(er) PFA i kylen för gradvis upptining.
- Placera den rekonstituerade levande/döda fläcken i mörkret (t.ex. en låda) för att tina vid rumstemperatur.
- Förbered bovint serumalbumin (BSA) Buffer. Tillsätt 0,5 g BSA till 100 ml 1x Dulbeccos fosfatbuffrade lösning utan kalcium och magnesium (D-PBS), pH 7,2.
- Tillsätt en omrörningsstång och blanda på en omrörningsplatta i 30 minuter. Överför till 50 ml koniska rör och förvara vid 4 °C.
OBS: Använd alltid nyberedd BSA-buffert. - Förbered levande / död fläck arbetsutspädning. Tillsätt 1 μL av den rekonstituerade lösningen med levande/död fläck till 360 μL D-PBS och förvara den i mörker (t.ex. en låda eller låda) vid rumstemperatur. Förbered 50 μL av arbetsutspädningen per prov.
3. Perfusion
- Lägg saltlösningen med heparin på is.
- Slå på syre, ställ in flödesmätarens indikatorkula på förångningssystemet för smådjursanestesi till 1 L / min. Se till att det finns tillräckligt med syretryck och isofluran.
- Justera vaporizerratten till 3,5% (för induktion och underhåll).
- Fyll på perfusionspumpledningarna med saltlösningen/heparinlösningen. Ställ in hastigheten på 6 ml/min.
- Placera musen i induktionskammaren, slå på andningen och vänta flera minuter tills musen inte svarar. Bekräfta tillräckligt med anestesidjup genom frånvaro av pedaluttag till skadlig nypa.
- Placera musen på ryggen på dissektionsbrickan med näsan i näskonen. Utför en sekundär bekräftelse av full bedövning genom frånvaro av pedaluttag till skadlig nypa. Fäst alla fyra tassarna på brickan.
- Spraya djurets buk med 20% etanol.
- Använd pincett, kläm fast underlivet och lyft huden. Använd sax för att skära genom päls och hud till botten av bröstkorgen.
- Gör två diagonala snitt under bröstkorgen mot varje axel.
- Resektera försiktigt membranet (undvik lungorna och hjärtat). Sätt i bröstkorgen för att exponera hjärtat.
- Skär försiktigt all bindväv runt hjärtat.
OBS: Steg 3.10-3.11 är kritiska; utföra med skicklighet och fingerfärdighet. - Använd saxen för att klippa det högra atriumet (mörk lob längst upp till vänster i hjärtat). Stäng av flödet av isofluran till andningen.
- Håll hjärtat stadigt med pincett. Med fjärilsnålens fasa uppåt, genomborra vänster kammare samtidigt som nålen hålls jämn och parallell med djuret.
- Håll nålen på plats, sätt på pumpen och perfusera minst 30 ml saltlösning / heparinlösning tills vätskan som lämnar hjärtat är ogenomskinlig och levern och lungorna bleka i färg.
OBS: Steg 3.13-3.14 är kritiska; utföra med skicklighet och fingerfärdighet. - Stäng av pumpen, ta bort nålen och överför musen till dissektionsområdet.
4. Dissektion
- Halshugg huvudet med en stor kirurgisk sax.
- Skär pälsen från baksidan av huvudet upp till ögonen. Skala huden tillbaka för att exponera skallen.
- Klipp skallen mellan ögonen. Gör två snitt på baksidan av skallen, vid klockan 10 och 2, gör sedan ett långt snitt (håll spetsarna uppe för att undvika att skada hjärnan) längs skallens mittagittala linje till det ursprungliga snittet mellan ögonen.
- Använd pincett för att skala bort de två halvorna av skallen åt sidorna. Använd en spatel för att ta bort hjärnan och placera den i en 60 mm petriskål i glas på is fylld med kall D-PBS (Figur 1).
- Använd en skalpell eller rakhyvel för att separera varje halvklot. Ta sedan bort luktlökarna och cerebellum.
- Använd pincett för att ta bort mitthjärnen tills hippocampus exponeras.
- Säkra hjärnan med pincett. Använd en andra uppsättning pincett, reta försiktigt hippocampus ut ur varje halvklot och överför båda hippocampi till ett märkt 1,5 ml rör som innehåller kall D-PBS.
- Placera provröret som innehåller de två hippocampi från musen på is.
5. Förbered enzymblandning 1 och 2 för varje prov
OBS: För volymer större än 2 ml, använd en 10 ml serologisk pipett; för volymer, 200 μL-2 ml, använd en 1000 μL pipett; för volymer, 21-199 μL, använd en 200 μL pipett; för volymer, 2-20 μL, använd en 20 μL pipett; För volymer under 2 μL, använd en 0-2 μL pipett.
- För varje prov, tina en alikvot vardera av enzym P och enzym A vid rumstemperatur.
- För enzymblandning 1, kombinera 50 μL enzym P och 1900 μL buffert Z i ett märkt C-rör (materialtabell).
- För enzymblandning 2, tillsätt 20 μL buffert Y till den tinade 10 μL alikvoten av enzym A.
6. Protokoll för dissociation av vuxna hjärnor17
OBS: Vid arbete med prover ska rör placeras i ett rörställ vid rumstemperatur medan BSA och D-PBS förblir på is om inte annat anges.
- Slå på dissociatorn.
- Använd pincett för att överföra hippocampivävnadsbitarna till C-röret.
- Överför 30 μL enzymblandning 2 till C-röret. Vrid locket tills spänningen känns och dra sedan åt tills det klickar.
- Placera C-röret upp och ner i en position av dissociatorn; Provet tilldelas statusen Vald (Figur 2). Fäst värmaren över C-röret.
- Tryck på mappikonen, välj Favoritmapp , bläddra till och välj 37C_ABDK_02 program. Klicka på OK för att tillämpa programmet på alla valda C-rör och tryck sedan på Start (Figur 2).
- Märk ett 50 ml koniskt rör per prov.
- Placera en 70 μm cellsil på varje 50 ml koniskt rör och våt med 2 ml BSA-buffert.
- När programmet är klart, ta bort värmaren och C-röret från dissociatorn.
- Tillsätt 4 ml BSA-buffert till provet och applicera blandningen på cellsilen på det 50 ml koniska röret.
- Tillsätt 10 ml D-PBS till C-röret, stäng det och virvla lösningen försiktigt. Applicera den på cellsilen på det 50 ml koniska röret.
- Kassera cellsilen och C-röret. Centrifugera suspensionen vid 300 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera sedan och kassera supernatanten.
7. Borttagning av skräp
- Resuspend pelletsen med 1550 μL kall D-PBS och överför suspensionen till ett märkt 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 450 μL kall skräpborttagningslösning och pipett upp och ner (virvel inte).
OBS: Debris Removal Solution är ett reagens i den kommersiella Adult Brian Dissociation Kit17. - Lägg försiktigt över 1 ml kall D-PBS ovanpå cellsuspensionen och håll spetsen mot det koniska rörets vägg. Upprepa tills det totala överlägget är 2 ml.
OBS: Detta steg är kritiskt; utföra med skicklighet och fingerfärdighet. - Centrifug vid 3000 x g i 10 min vid 4 °C med full acceleration och full broms.
OBS: Om faserna inte är tydligt åtskilda, upprepa steg 7.2-7.3. Centrifug en sista gång vid 1000 x g i 10 min vid 4 °C. - Suspensionen ska nu bestå av tre distinkta lager (figur 3). Aspirera det översta lagret. Svep pipettspetsen fram och tillbaka för att aspirera det vita mellanskiktet. Ta bort så mycket av mellanskiktet som möjligt utan att störa det nedersta lagret.
OBS: Detta steg är kritiskt; utföra med skicklighet och fingerfärdighet. - Tillsätt 2 ml kall D-PBS och pipett upp och ner för att blanda.
- Centrifug vid 1000 x g i 10 min vid 4 °C med full acceleration och full broms. Aspirera och kassera supernatanten. Återsuspendera pelletsen i 1 ml BSA-buffert.
OBS: Celler kan återanvändas i lämplig buffert och sedan magnetiskt märkas och isoleras som förberedelse för encellssekvensering vid denna tidpunkt.
8. Antal celler
- Utför cellräkning enligt tillverkarens protokoll för tillgänglig cellräknare (ett alternativ noteras i materialförteckningen)
9. Levande / död fläck
- Centrifugera resterande 900 μL (från 7,7) vid 1000 x g i 10 min vid 4 °C med full acceleration och full broms.
- Medan provet snurrar, märk ett flödesrör per prov och linda det i folie för att begränsa ljusexponeringen.
- Aspirera och kassera supernatanten.
- Återutnytt pelleten i 50 μL utspädd levande/död fläck (tidigare beredd).
OBS: Detta steg bör utföras i svagt ljus. Stäng av taklamporna för att uppnå detta. - Överför varje prov till motsvarande märkta flödesrör och inkubera vid rumstemperatur i 8-10 minuter i mörkret (t.ex. en låda eller låda).
- Tillsätt 500 μL BSA-buffert och centrifug vid 1 000 x g i 10 min vid 4 °C med full acceleration och full broms.
- Aspirera och kassera supernatanten.
OBS: Pelletsen kanske inte är synlig; lämna en liten mängd buffert bakom för att inte oavsiktligt aspirera pelletsen. Celler kan återanvändas i lämplig buffert, blockeras och färgas med cellspecifika antikroppar vid denna tidpunkt. Se kompletterande fil 1 för exempelprotokoll18.
10. Fixering (valfritt)
- Resuspend pelletsen i 200 μL av 1% PFA (tidigare beredd). Inkubera i 15 min vid 4 °C.
- Tvätta genom att tillsätta 500 μL D-PBS och centrifug vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten.
OBS: Pelletsen kanske inte är synlig; lämna en liten mängd buffert bakom för att inte oavsiktligt aspirera pelletsen. - Återutspäd pelletsen i 200 μL D-PBS och förvara vid 4 °C i upp till 3 dagar.
11. Flödescytometri
- Märk filterlocken på de nya rören.
- Använd en 1 ml pipett och pipettera varje prov på filterlocket.
- Centrifugera kort vid 200 x g vid 4 °C, vilket gör att centrifugen bara kan nå 200 x g innan körningen stoppas.
- Fortsätt till flödescytometrikärnan för nedströms analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prover bearbetades med en flödescytometer vid en kärnanläggning, och de resulterande uppgifterna utvärderades med ett mjukvarupaket för flödesanalys. Tidigare analyserades kompensationskontroller - den levande / döda fläcken och negativ kontroll. Om flera fluorokromer används bör fluorescens minus en (FMO) kontroller och enfläckskontroller förberedas för varje antikropp. Kompensation för spektral överlappning för de experimentella proverna beräknades baserat på de analyserade kontrollerna. För identifiering av cellpopulationer användes en hierarkisk gatingstrategi. Den primära porten uteslöt skräp i diagrammet framåtspridning (cellstorlek) kontra sidospridning (granularitet)19,20. Därefter uteslöts de döda cellerna (figur 4, figur 5, figur 6, kompletterande figur 1, kompletterande figur 2, kompletterande figur 3 och kompletterande figur 4). Följande grind exkluderade celler som var positiva för Myelin Basic Protein (kompletterande figur 4). Av de återstående cellerna skapades densitetsdiagram av celler som är positiva för varje fluorokrom (kompletterande figur 4). Frekvensen för varje neuronal cellpopulation beräknades ut ur den tredje porten (kompletterande figur 4). Prover som bearbetades med manuell mekanisk dissociation21 och enzymatisk matsmältning gav en väsentligt lägre population av celler av intresse (kompletterande fil 221, figur 4 och kompletterande figur 1). Omvänt returnerade både fasta och färska prover framställda via automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning en population av celler av intresse som var flera gånger större (figur 5, figur 6, kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3).
Figur 1: Mushjärna. (A) Korrekt perfuserad. (B) Icke-perfuserad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Vald status i steg 6.4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Treskiktad suspension i steg 7.5: Buffert (toppskikt), cellskräp, skräpborttagningslösning och celler (bottenlager). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ analys av fasta prover som bearbetats med användning av en kombination av manuell dissociation genom Pasteur-pipetttriturering och enzymatisk matsmältning. Först av två prover som bearbetas samtidigt. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativ analys av färska prover som bearbetats med en kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning. Först av två prover som bearbetas samtidigt. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Representativ analys av fasta prover som bearbetats med användning av en kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk rötning. Först av två prover som bearbetas samtidigt. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Representativ analys av fasta prover bearbetade med en kombination av manuell pasteurpipetttriturationsdissociation och enzymatisk matsmältning. Andra av två prover som bearbetas samtidigt. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Representativ analys av färska prover som bearbetats med användning av en kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning. Andra av två prover som bearbetas samtidigt. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Representativ analys av fasta prover som bearbetats med användning av en kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning. Andra av två prover som bearbetas samtidigt. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Representativ analys av färgade och fasta prover bearbetade med en kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning. (A) Procentandel av celler som är den cellulära befolkningen av intresse. (B) Procentandel av befolkningen av intresse som är levande celler. (C). MBP- Celler. (D). PSA-NCAM+ celler (Neuronala prekursorceller). (E). ACSA2+ celler (astrocyter). (F). CD31+ celler (endotelial). (G). CD11b+ celler (Microglia). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Färgningsprotokoll. Ett provfärgningsprotokoll för immunfärgning av cellytemarkörer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Anpassat manuellt mekaniskt och enzymatiskt dissociationsprotokoll. Denna metod är anpassad från ett tidigare publicerat protokoll21. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera steg i detta neurala dissociationsprotokoll kräver skicklig teknik och fingerfärdighet-perfusion, supernatant aspiration och myelinavlägsnande. Under hela perfusionsprocessen måste de inre organen förbli intakta (bortsett från att ta bort membranet och klippa hjärtat); detta inkluderar att undvika hjärtans övre kamrar med fjärilsnålen. Medan mängden saltlösning med heparin som behövs varierar, indikerar transparent vätska som strömmar från hjärtat att processen är klar. Hjärnan måste vara helt och ordentligt perfuserad, vid vilken tidpunkt den kommer att se off-white (Figur 1). Med perfusion blir det röda blodkroppsborttagningssteget främmande, vilket eliminerar överflödig manipulation av proverna som kan leda till cellförlust. Därefter kräver skräpborttagningssteget en stadig hand. För att centrifugeringen ska resultera i tydligt definierade skikt efter D-PBS-överlägget (figur 3) får skikten inte störas under transport eller under pipettering. Dessutom, när du aspirera de två översta skikten, måste tillräckligt med suspension avlägsnas för att eliminera överdriven cellskräp samtidigt som du lämnar ett tillräckligt stort prov bakom. Detta är ett viktigt steg eftersom döda celler är mer benägna att binda ospecifikt och bli autofluorescent22,23, vilket ytterligare betonar vikten av att välja en metod som konsekvent resulterar i hög cellviabilitet. Slutligen, när man aspirerar supernatanten, kanske pelletsen inte alltid är synlig. En liten mängd kvarvarande supernatant måste lämnas för att säkerställa att provet inte kasseras av misstag.
Det finns fördelar och nackdelar med att fixera proverna. Inte alla antikroppsmarkörer är kompatibla med fixering, vilket begränsar nedströms analys beroende på de cellpopulationer som är av intresse. Att använda alltför koncentrerad PFA eller lämna cellerna i fixeringsmedlet under en längre tid kan också resultera i autofluorescens och falskt positiva avläsningar, vilket förvirrar resultaten24,25. Genom att använda en 1% PFA-lösning och minimera exponeringen av cellerna minskar sannolikheten för falskt positiva avläsningar kraftigt. Eftersom denna procedur är detaljerad och har många tidsvariabler, placerar användning av färska celler laboratorier under strikta tidsbegränsningar för att säkerställa att cellerna förblir livskraftiga. Fixering bevarar cellstrukturen för analys nästa dag.
Encellsanalys kan ge viktiga insikter om behandlingseffekt, cellfunktion och sjukdoms- eller behandlingsmekanismer. Exempel på metoder inkluderar encells-DNA och RNA-sekvensering 26,27, cytometri efter flygtid 22,28, flödescytometri och immunohistokemi. Med encellig mRNA-sekvensering kan genuttryck vid tidpunkten för provtagning ge celltypsspecifika insikter26. Till exempel utförde en forskargrupp encellig RNA-sekvensering på D1- och D2-dopaminreceptorer som uttrycker medelstora taggiga neuronsubtyper från dorsomedial striatum27. Gruppen omdefinierade transkriptomet av medelstora taggiga neuroner genom att detektera nya subtypspecifika markörgener och identifiera gener som tidigare och felaktigt rapporterades vara differentiellt uttryckta på grund av brist på encellsupplösning27. Ho et al. lyfte fram potentialen hos encellig RNA-sekvensering för att upptäcka celltypsspecifika läkemedelsmål27. Med encellig DNA-sekvensering kan förändringar i genuttryck beskrivas genom mätning av DNA- och histonmodifieringar, kromatintillgänglighet och kromatinkonformation26. Vid mätning av DNA-metylering med en enda kärna konstruerade Liu et al. en encellig DNA-metylometlas av 45 mushjärnregioner och identifierade 161 neuronala celltyper29. Provberedning för encellssekvensering är mer invecklad, särskilt isoleringen av encelliga celler och borttagning av skräp. Mattei et al. undersökte effekten av enzymatisk och mekanisk dissociation på transkriptomisk och proteotypprofilering och noterar att neurala dissociationsmetoder i sig introducerar en nivå av bias30. Flera grupper har noterat vikten av att arbeta effektivt, dissekera på is och använda transkriptionshämmare 26,30,31. Mattei et al. identifierade också drabbade gener och proteiner för att informera analys30. Dessa tekniker ger emellertid fortfarande detaljerad insikt i cellulära byggstenar som är oöverträffade av bulkvävnadstranskriptomik26,27.
Flödescytometri är ett kraftfullt analysverktyg som samtidigt kan identifiera och mäta parametrar för encelliga populationer med hjälp av fluorescerande sonder. Vissa tillämpningar av flödescytometrar inkluderar cellcykelanalys, cellsortering, livskraft, fenotypning, cellproliferation och funktionella analyser32,33. De flesta av dessa applikationer använder ytfärgning på grund av tillgängligheten av cellytproteiner. Dessa proteiner kan färgas för att identifiera specifika cellpopulationer baserat på härstamning, utvecklingsstadium och funktion 19,32,33. Till exempel kan prover färgas för att identifiera populationer av astrocyter, endotelceller, neuronala prekursorceller och mikroglia34. En primär fördel vid färgning av ytproteiner från levande celler är att kunna sortera cellerna samtidigt som man behåller möjligheten att genomföra ytterligare nedströms analys34. Medan ytfärgningstekniker är ganska standard är intracellulär färgning ett mer känsligt förfarande. Med intracellulär flödescytometri måste cellerna fixeras och permeabiliseras före färgning för att antikroppen ska kunna korsa cellmembranet 20,32,33,34. Helst kommer cellmorfologin att förbli intakt; Permeabilisering riskerar dock proteindenaturering, vilket skulle påverka antikroppsdetektionennegativt 22,34. Vissa metoder för vidare nedströms analys är inte längre ett alternativ när cellerna är fixerade20. Medan nackdelarna med intracellulär färgning är mer uttalade än ytfärgning, tillåter den förra detektion och analys av intracellulära molekyler som annars inte skulle vara troliga. Dessutom kan cellyte- och intracellulära färgningsförfaranden kopplas för att definitivt identifiera vissa celltyper eller bedöma ytterligare parametrar samtidigt 20,28,34.
Det finns flera metoder för neural dissociation som kan användas för att förbereda den encelliga suspension som krävs för cellulär analys, även om de inte är lika effektiva. Jämfört med standardiserade kit och ovannämnda tekniker är denna speciella metod för neural dissociation avsedd för bearbetning av små mängder vävnad, ger en mycket livskraftig encellssuspension (>90%) och effektiviserar experimentet. Med detta protokoll är andra laboratorier utrustade för att utföra neural dissociation på ett pålitligt och reproducerbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Aimee Rogers för att ha tillhandahållit praktisk utbildning och fortsatt produktsupport. Vi tackar Dr. Amanda Burke för pågående felsökning och klargörande diskussioner. Vi tackar Meredith Joheim och UAMS Science Communication Group för den grammatiska redigeringen och formateringen av detta manuskript. Denna studie stöddes av NIH R25GM083247 och NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H.
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K.
- Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H.
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M.
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
- Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).
