Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar
Summary
Nanopartikül izleme analizi (NTA), hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu makale, NTA deneysel parametrelerini ve kontrollerini ve ayrıca MISEV2018 ve EV-TRACK tarafından laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik için önerilen kılavuzları desteklemek için gerekli numunelerin ve seyrelticilerin tek tip bir analiz ve karakterizasyon yöntemini vurgulamaktadır.
Abstract
Nanopartikül izleme analizi (NTA), 2006 yılından bu yana hücre dışı vezikül (EV) araştırmaları için kullanılan çeşitli karakterizasyon yöntemlerinden biri olmuştur. Birçoğu, NTA cihazlarının ve yazılım paketlerinin minimum eğitimin ardından kolayca kullanılabileceğini ve boyut kalibrasyonunun şirket içinde mümkün olduğunu düşünmektedir. Hem NTA edinimi hem de yazılım analizi EV karakterizasyonunu oluşturduğundan, Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018’de (MISEV2018) ele alınmıştır. Ek olarak, EV deneylerinin sağlamlığını artırmak için Şeffaf Raporlama ve Hücre Dışı Vezikül Araştırmalarında Merkezi Bilgi (EV-TRACK) tarafından izlenmiştir (örneğin, kontrolsüz faktörler nedeniyle deneysel varyasyonu en aza indirmek).
Yöntemlerin ve kontrollerin raporlanmasını teşvik etme çabalarına rağmen, yayınlanan birçok araştırma makalesi, orijinal NTA gözlemlerini çoğaltmak için gereken kritik ayarları rapor etmede başarısız olmaktadır. Çok az sayıda makale, negatif kontrollerin veya seyrelticilerin NTA karakterizasyonunu, fosfat tamponlu salin veya ultra saf damıtılmış su gibi ticari olarak temin edilebilen ürünlerin partikülsüz olduğunu varsayarak açıkça bildirmektedir. Benzer şekilde, pozitif kontroller veya boyut standartları, parçacık boyutlandırmasını doğrulamak için araştırmacılar tarafından nadiren rapor edilir. Stokes-Einstein denklemi, parçacık yer değiştirmesini belirlemek için numune viskozitesini ve sıcaklık değişkenlerini içerir. Bu nedenle, tüm numune video toplama işlemi sırasında kararlı lazer odası sıcaklığının raporlanması, doğru replikasyon için önemli bir kontrol ölçüsüdür. Numunelerin veya seyrelticilerin filtrasyonu da rutin olarak rapor edilmez ve eğer öyleyse, filtrenin özellikleri (üretici, membran malzemesi, gözenek boyutu) ve depolama koşulları nadiren dahil edilir. Uluslararası Hücre Dışı Vezikül Derneği’nin (ISEV) kabul edilebilir deneysel ayrıntıların asgari standartları, EV’lerin karakterizasyonu için iyi belgelenmiş bir NTA protokolü içermelidir. Aşağıdaki deney, bireysel araştırmacı tarafından bir NTA analiz protokolünün oluşturulması gerektiğine ve tek vezikül karakterizasyonu için MISEV2018 gereksinimlerini yerine getirme seçeneklerinden biri olarak NTA karakterizasyonunu kullanan yayın yöntemlerine dahil edilmesi gerektiğine dair kanıtlar sunmaktadır.
Introduction
EV’lerin ve diğer nanometre ölçekli parçacıkların doğru ve tekrarlanabilir analizi, araştırma ve endüstri genelinde çok sayıda zorluk ortaya koymaktadır. EV araştırmasının çoğaltılması, kısmen, veri toplama ile ilişkili gerekli parametrelerin raporlanmasında tekdüzelik olmaması nedeniyle zor olmuştur. Bu eksiklikleri gidermek için ISEV, EV araştırmacıları için asgari bir biyokimyasal, biyofiziksel ve fonksiyonel standartlar kümesi olarak endüstri kılavuzları önerdi ve bunları genellikle MISEV20141 olarak adlandırılan bir pozisyon beyanı olarak yayınladı. EV araştırmasının hızlanan hızı, güncellenmiş bir kılavuz gerektiriyordu ve “MISEV2018: ISEV’in bir pozisyon beyanı”, MISEV2014 kılavuzlarınıgenişletti 2. MISEV2018 makalesi, tablolar, önerilen protokollerin ana hatları ve belirli EV ile ilişkili karakterizasyonu belgelemek için izlenecek adımları içeriyordu. Deneylerin yorumlanmasını ve çoğaltılmasını kolaylaştırmak için bir başka önlem olarak, EV-TRACK, EV biyolojisinin ve yayınlanan sonuçlar için kullanılan metodolojinin daha şeffaf bir şekilde raporlanmasını sağlamak için kitle kaynaklı bir bilgi tabanı (http://evtrack.org) olarak geliştirilmiştir3. Yöntemlerin standartlaştırılmış raporlaması için bu önerilere rağmen, alan yayınlanan sonuçların çoğaltılması ve doğrulanması konusunda acı çekmeye devam etmektedir.
Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Bilim Vakfı’nın kalite değerlendirme araçlarına yönelik çabalarına uyan bu makale, ISEV’in veri değerlendirme araçlarının laboratuvarlar arasında sonuçların çoğaltılması amacıyla uygulanabilmesi için yöntemlerin ve ayrıntıların standartlaştırılmış bir şekilde raporlanmasını gerektirdiğini göstermektedir. Hücre kaynaklarının raporlanması, hücre kültürü prosedürleri ve EV izolasyon yöntemleri, EV popülasyonunun niteliklerini tanımlamak için önemli faktörlerdir. NTA cihazları arasında, algılama ayarları, taşıyıcı sıvının kırılma indisi, polidispersiteye katkıda bulunan heterojen parçacık popülasyonları, standartlaştırılmış raporlama gereksinimlerinin eksikliği ve gözlemciler arası ve gözlemciler arası ölçüm sonuçlarının bulunmaması gibi faktörler, laboratuvarlar arasında NTA karşılaştırmasını zorlaştırır veya imkansız hale getirir.
2006’dan beri kullanımda olan NTA, şu anda EV araştırmacılarının yaklaşık% 80’i tarafından kullanılan nanopartikül boyutu ve konsantrasyon tayini için popüler bir yöntemdir4. MISEV2018 Kılavuzları, NTA’nın popüler seçeneklerden biri olduğu iki tür tek vezikül analizi gerektirir. NTA, geniş erişilebilirliği, numune başına düşük maliyeti ve basit kurucu teorisi (Stokes-Einstein denklemi) nedeniyle EV karakterizasyonu için ortak kullanımda olmaya devam etmektedir. NTA tarafından yapılan EV değerlendirmesi, lazer ışık saçılması ve Brownian hareket analizi kullanılarak bir partikül boyutu dağılımı ve konsantrasyon tahmini oluşturur ve alt algılama sınırı EV’nin kırılma indisi tarafından belirlenir. Bilinen viskozite ve sıcaklığa sahip akışkan bir numune kullanıldığında, EV’lerin yörüngeleri, ortalama kare yer değiştirmelerini iki boyutta belirlemek için izlenir. Bu, parçacık difüzyon katsayısının hesaplanmasını ve modifiye edilmiş bir Stokes-Einstein denklemi 5,6,7 ile küreye eşdeğer bir hidrodinamik çapa dönüştürülmesini sağlar. NTA’nın parçacık-parçacık analizi, heterojen bir EV popülasyonundaki aglomeralar veya daha büyük parçacıklar tarafından diğer karakterizasyon yöntemlerinden daha az girişime sahiptir7. Birkaç büyük parçacık boyutlandırma doğruluğu üzerinde minimum etkiye sahip olsa da, küçük miktarlarda büyük, yüksek ışık saçan parçacıkların varlığı, azaltılmış yazılım EV algılama ve izleme8 nedeniyle daha küçük parçacıkların algılanmasında kayda değer bir azalmaya neden olur. Bir ölçüm tekniği olarak, NTA’nın genellikle daha büyük parçacıklara veya parçacık agregalarına karşı önyargılı olmadığı düşünülür, ancak bireysel parçacık analizi9 yoluyla çok boyutlu popülasyonları çözebilir. Parçacıklar tarafından ışık saçılmasının kullanılması nedeniyle, NTA analizinin sınırlamalarından biri, EV’lere kıyasla benzer kırılma ve boyut özelliklerine sahip toz, plastik veya toz gibi herhangi bir partikülün bu karakterizasyon yöntemiyle gerçek EV’lerden ayırt edilememesidir.
NanoSight LM10 (nanopartikül boyutu analizörü) ve LM14 (lazer modülü) 2006’dan beri satılmaktadır ve bu cihazın daha yeni modelleri geliştirilmiş olmasına rağmen, bu özel model birçok temel tesiste bulunur ve güvenilir bir iş gücü olarak kabul edilir. Boyut ve konsantrasyonun yüksek çözünürlüklü ölçümleri için NTA ayarlarını uygun şekilde optimize etmek için eğitim gereklidir. Optimum video kayıtları için gereken iki önemli ayar (1) kamera seviyesi ve (2) algılama eşiğidir. Bunlar, numunenin özelliklerine göre operatör tarafından ayarlanmalıdır. NTA analizinin en önemli kısıtlamalarından biri, 107 ila 109 partikül / mL arasındaki numune konsantrasyonlarının önerilmesidir, bu numune seyreltmesini sağlamak içingerekli olabilir 10. Fosfat tamponlu salin, 0,15 M salin veya ultra saf su gibi seyreltme için kullanılan çözeltiler, NTA ölçümlerini etkileyebilecek 220 μm’den küçük parçacıklardan nadiren arındırılmıştır. Seyreltme için kullanılan çözeltilerin NTA karakterizasyonu, analiz edilen nanopartikül örnekleri ile aynı kamera seviyesinde ve algılama eşiğinde yapılmalıdır. EV numune seyreltmeleri için kullanılan seyrelticilerde bulunan nanopartiküllerin büyüklüğü ve konsantrasyonu, EV’lerin NTA analizini içeren yayınlara nadiren dahil edilir.
Bu protokol, kamera seviyesinin, algılama eşiğinin veya örnek filtrasyonunun NTA veri kümesi üzerindeki sistematik etkilerini analiz etmek için seçilen kamera seviyeleri, algılama eşikleri ve numunelerin mekanik filtrelenmesi kullanılarak değerlendirilen sentetik EV benzeri lipozomların NTA analizini kullanır. Lipozomlar Ek Dosya S1’de açıklandığı gibi sentezlendi. Bu deneyde sentetik lipozomlar, boyut homojenlikleri, fiziksel özellikleri ve 4 ° C’de depolamadaki stabiliteleri nedeniyle kullanılmıştır. EV’lerin gerçek örnekleri kullanılmış olsa da, EV’lerin depolama sırasındaki heterojenliği ve stabilitesi bu çalışmayı ve yorumlanmasını zorlaştırmış olabilir. (A) lipozomlardan ve (B) EV’lerden NTA raporlarındaki benzerlikler, bu makalede lipozomlar için ortaya konan sistematik etkilerin muhtemelen EV karakterizasyonu için de geçerli olacağını göstermektedir (Şekil 1). Bu bulgular birlikte, kritik yazılım ayarlarının tam raporlanmasının ve seyreltici, seyreltme ve filtreleme gibi örnek işlemenin tanımının NTA verilerinin tekrarlanabilirliğini etkilediği fikrini desteklemektedir.
Bu makalenin amacı, NTA ayarlarının (sıcaklık, kamera seviyesi ve algılama eşiği) ve numune hazırlamanın değiştirilmesinin toplanan sonuçları değiştirdiğini göstermektir: sistematik, boyut ve konsantrasyonda önemli farklılıklar elde edilmiştir. NTA, MISEV2018 karakterizasyon spesifikasyonunu yerine getirmek için popüler seçeneklerden biri olduğundan, bu sonuçlar tekrarlanabilirliği sağlamak için numune hazırlama ve NTA ayarlarının raporlanmasının önemini göstermektedir.
Şekil 1: Temsilci NTA, lipozomları EV’lerle karşılaştırmak için rapor verir. (A) Lipozomlar: 12 Mart 2020’de NTA’da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. (B) EV’ler: 26 Ağustos 2021 tarihinde NTA’da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. Kısaltmalar: NTA = Nanopartikül izleme analizi; EV’ler = hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopartiküllerin boyutunu ve konsantrasyonunu tahmin etmek için çeşitli yöntemler vardır11. Bunlar, dinamik ışık saçılması (DLS), santrifüjlü çökeltme ve tek parçacık seviyesi analizi-elektron mikroskobu, NTA, atomik kuvvet mikroskobu ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama dahil olmak üzere bir popülasyondan boyut tahmini üreten topluluk yöntemlerini içerir. Bunlardan DLS ve NTA, ideal bir ortamda Brownian hareketine dayanan tahribatsız boyut ve konsantrasyon ölçüm …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Kansas eyaleti tarafından Midwest Karşılaştırmalı Kök Hücre Biyolojisi Enstitüsü’ne (MICSCB), Johnson Kanser Araştırma Merkezi’nden MLW’ye ve NIH R21AG066488’den LKC’ye desteklendi. OLS, MICSCB’den GRA desteği aldı. Yazarlar, bu projede kullanılan lipozomları sağladığı için Dr. Santosh Aryal’a ve yararlı konuşmalar ve geri bildirimler için Weiss ve Christenson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyor. Dr. Hong He’ye teknik destek için teşekkür edilir. MLW, Betti Goren Weiss’a desteği ve danışmanlığı için teşekkür eder.
Materials
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
Referências
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -. T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
- Malvern analytical Ltd. . NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
- Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
- Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
- vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
