Forbedring af reproducerbarheden for at imødekomme minimal information til undersøgelser af ekstracellulære vesikler 2018-retningslinjer i nanopartikelsporingsanalyse

Summary

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) er en meget anvendt metode til at karakterisere ekstracellulære vesikler. Dette papir fremhæver NTA eksperimentelle parametre og kontroller plus en ensartet metode til analyse og karakterisering af prøver og fortyndingsmidler, der er nødvendige for at supplere de retningslinjer, der er foreslået af MISEV2018 og EV-TRACK for reproducerbarhed mellem laboratorier.

Abstract

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) har været en af flere karakteriseringsmetoder, der anvendes til ekstracellulær vesikelforskning (EV) siden 2006. Mange mener, at NTA-instrumenter og deres softwarepakker let kan bruges efter minimal træning, og at størrelseskalibrering er mulig internt. Da både NTA-erhvervelse og softwareanalyse udgør EV-karakterisering, behandles de i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Derudover er de blevet overvåget af Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) for at forbedre robustheden af EV-eksperimenter (f.eks. minimere eksperimentel variation på grund af ukontrollerede faktorer).

På trods af bestræbelser på at tilskynde til rapportering af metoder og kontroller undlader mange offentliggjorte forskningsartikler at rapportere kritiske indstillinger, der er nødvendige for at gengive de originale NTA-observationer. Få papirer rapporterer NTA-karakteriseringen af negative kontroller eller fortyndingsmidler, åbenbart forudsat at kommercielt tilgængelige produkter, såsom fosfatbufret saltvand eller ultrarent destilleret vand, er partikelfrie. Tilsvarende rapporteres positive kontroller eller størrelsesstandarder sjældent af forskere for at verificere partikelstørrelse. Stokes-Einstein-ligningen indeholder prøveviskositet og temperaturvariabler for at bestemme partikelforskydning. Rapportering af den stabile laserkammertemperatur under hele prøvevideosamlingen er derfor en vigtig kontrolforanstaltning for nøjagtig replikering. Filtrering af prøver eller fortyndingsmidler rapporteres heller ikke rutinemæssigt, og i så fald er filterets specifikationer (producent, membranmateriale, porestørrelse) og opbevaringsbetingelser sjældent inkluderet. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV)’s minimumsstandarder for acceptable eksperimentelle detaljer bør omfatte en veldokumenteret NTA-protokol til karakterisering af elbiler. Følgende eksperiment giver bevis for, at en NTA-analyseprotokol skal etableres af den enkelte forsker og indgå i metoderne til publikationer, der bruger NTA-karakterisering som en af mulighederne for at opfylde MISEV2018-kravene til enkelt vesikelkarakterisering.

Introduction

Nøjagtig og repeterbar analyse af elbiler og andre nanometerskalerede partikler giver mange udfordringer på tværs af forskning og industri. Det har været vanskeligt at kopiere forskning i elbiler, til dels på grund af den manglende ensartethed i rapporteringen af de nødvendige parametre i forbindelse med dataindsamling. For at afhjælpe disse mangler foreslog ISEV industriretningslinjer som et minimalt sæt biokemiske, biofysiske og funktionelle standarder for EV-forskere og offentliggjorde dem som en holdningserklæring, almindeligvis benævnt MISEV2014¹. Det accelererende tempo i EV-forskningen krævede en opdateret retningslinje, og “MISEV2018: a position statement of the ISEV” udvidede MISEV2014-retningslinjerne². MISEV2018-papiret indeholdt tabeller, konturer af foreslåede protokoller og trin, der skulle følges for at dokumentere specifik EV-associeret karakterisering. Som en yderligere foranstaltning for at lette fortolkningen og replikeringen af eksperimenter blev EV-TRACK udviklet som en crowd-sourcing vidensbase (http://evtrack.org) for at muliggøre en mere gennemsigtig rapportering af EV-biologi og den metode, der anvendes til offentliggjorte resultater³. På trods af disse anbefalinger til standardiseret rapportering af metoder lider feltet fortsat med hensyn til replikering og bekræftelse af offentliggjorte resultater.

I tilpasning til National Institutes of Health’s og National Science Foundations indsats for kvalitetsvurderingsværktøjer antyder dette papir, at ISEV kræver standardiseret rapportering af metoder og detaljer, så datavurderingsværktøjer kan anvendes med det formål at replikere resultater mellem laboratorier. Rapportering af cellekilder, cellekulturprocedurer og EV-isolationsmetoder er vigtige faktorer for at definere EV-populationens kvaliteter. Blandt NTA-instrumenter gør faktorer som detektionsindstillinger, brydningsindekset for bærervæske, heterogene partikelpopulationer, der bidrager til polydispersitet, mangel på standardiserede rapporteringskrav og fraværende intra- og interobservatørmåleresultater NTA-sammenligning mellem laboratorier vanskelig eller umulig.

NTA har i brug siden 2006 og er en populær metode til bestemmelse af nanopartikelstørrelse og koncentration, der i øjeblikket anvendes af ca. 80% af EV-forskerne⁴. MISEV2018-retningslinjerne kræver to former for enkelt-vesicle-analyse, hvoraf NTA er en af de populære muligheder. NTA fortsætter med at være i almindelig brug til EV-karakterisering på grund af dens brede tilgængelighed, lave omkostninger pr. Prøve og dens ligefremme grundlæggende teori (Stokes-Einstein-ligningen). EV-vurdering fra NTA genererer en partikelstørrelsesfordeling og koncentrationsestimat ved hjælp af laserlysspredning og brownsk bevægelsesanalyse, med den nedre detektionsgrænse bestemt af EV’ens brydningsindeks. Ved anvendelse af en væskeprøve med kendt viskositet og temperatur spores elbilernes baner for at bestemme deres gennemsnitlige kvadratiske forskydning i to dimensioner. Dette gør det muligt at beregne partikeldiffusionskoefficienten og konvertere til en kugleækvivalent hydrodynamisk diameter ved en modificeret Stokes-Einstein-ligning ^5,6,7. NTA’s partikel-til-partikel-analyse har mindre interferens fra agglomerater eller større partikler i en heterogen population af elbiler end andre metoder til karakterisering⁷. Mens nogle få større partikler har minimal indflydelse på størrelsesnøjagtigheden, resulterer tilstedeværelsen af lige små mængder store, høje lysspredningspartikler i en bemærkelsesværdig reduktion i detektionen af mindre partikler på grund af reduceret software EV-detektion og sporing⁸. Som måleteknik anses NTA generelt for ikke at være forudindtaget mod større partikler eller aggregater af partikler, men kan løse populationer af flere størrelser gennem individuel partikelanalyse⁹. På grund af brugen af lysspredning af partikler er en af begrænsningerne ved NTA-analyse, at partikler som støv, plast eller pulver med lignende brydnings- og størrelsesattributter sammenlignet med elbiler ikke kan differentieres fra faktiske elbiler ved denne karakteriseringsmetode.

NanoSight LM10 (nanopartikelstørrelsesanalysator) og LM14 (lasermodul) er blevet solgt siden 2006, og selvom nyere modeller af dette instrument er blevet udviklet, findes denne særlige model i mange kernefaciliteter og betragtes som en pålidelig arbejdshest. Træning er nødvendig for korrekt optimering af NTA-indstillingerne til målinger af størrelse og koncentration i høj opløsning. De to vigtige indstillinger, der er nødvendige for optimale videooptagelser, er (1) kameraniveauet og (2) detektionstærsklen. Disse skal fastsættes af driftslederen på grundlag af prøvens egenskaber. En af de største begrænsninger ved NTA-analyse er anbefalingen af prøvekoncentrationer mellem 10⁷ og 10⁹ partikler/ml, for at opnå denne prøvefortynding kan det være nødvendigt¹⁰. Opløsninger, der anvendes til fortynding, såsom fosfatbufret saltvand, 0,15 M saltvand eller ultrarent vand, er sjældent fri for partikler under 220 μm i størrelse, hvilket kan påvirke NTA-målingerne. NTA-karakterisering af de opløsninger, der anvendes til fortynding, skal udføres på samme kameraniveau og detektionstærskel som de nanopartikelprøver, der analyseres. Størrelsen og koncentrationen af nanopartikler, der er til stede i fortyndingsmidler, der anvendes til fortyndinger af EV-prøver, indgår sjældent i publikationer, der involverer NTA-analyse af EV’er.

Denne protokol bruger NTA-analyse af syntetiske EV-lignende liposomer evalueret ved hjælp af udvalgte kameraniveauer, detektionstærskler og mekanisk filtrering af prøverne til at analysere de systematiske virkninger af kameraniveau, detektionstærskel eller prøvefiltrering på NTA-datasættet. Liposomer blev syntetiseret som beskrevet i Supplerende fil S1. Syntetiske liposomer blev anvendt i dette eksperiment på grund af deres størrelse ensartethed, fysiske egenskaber og stabilitet i opbevaring ved 4 ° C. Selv om der kunne have været anvendt faktiske prøver af elbiler, kan heterogeniciteten og stabiliteten af elbiler under opbevaring have kompliceret denne undersøgelse og dens fortolkning. Ligheder i NTA-rapporterne fra (A) liposomer og (B) EV’er indikerer, at de systematiske virkninger, der afsløres for liposomer i dette papir, sandsynligvis også vil gælde for EV-karakterisering (figur 1). Tilsammen understøtter disse resultater forestillingen om, at fuldstændig rapportering af kritiske softwareindstillinger og beskrivelsen af prøvebehandling, såsom fortyndingsvæske, fortynding og filtrering, påvirker reproducerbarheden af NTA-data.

Formålet med dette papir er at demonstrere, at variation af NTA-indstillingerne (temperatur, kameraniveau og detektionstærskel) og prøveforberedelse ændrer de indsamlede resultater: systematiske, signifikante forskelle i størrelse og koncentration blev opnået. Da NTA er en af de populære muligheder for at opfylde MISEV2018-karakteriseringsspecifikationen, viser disse resultater vigtigheden af at rapportere prøveforberedelse og NTA-indstillinger for at sikre reproducerbarhed.

Figur 1: Repræsentative NTA-rapporter for at sammenligne liposomer med elbiler. (A) Liposomer: ufiltreret prøve karakteriseret på NTA den 12. marts 2020. (B) Elbiler: ufiltreret prøve karakteriseret på NTA den 26. august 2021. Forkortelser: NTA = Nanopartikelsporingsanalyse; ELBILER = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Generelle retningslinjer for protokollen Oprethold mikroskopet på et luftbord eller som minimum på et vibrationsfrit bord. Sørg for, at fremmede vibrationer (f.eks. Fodtapning på gulvet, berøring af bordet, dørlukninger, laboratorietrafik) holdes på et minimum. Indstil og oprethold lasermodulets temperatur ved en konstant temperatur for alle videooptagelser.BEMÆRK: Den valgte temperatur var 25 °C, fordi analysatoren af nanopartikelstørrelse blev kalibreret ved denne t…

Representative Results

Tabel 1 indeholder resultaterne af NTA-videoerne for liposomprøverne (18 filtrerede og 18 ufiltrerede) og et repræsentativt DPBS-fortyndingsmiddel. Sammenligninger på tværs af de to grupper blev gennemført uanset kameraniveau eller detektionstærskel i dette papir. Filtrerede prøver havde en gennemsnitlig partikeldiameter på 108,5 nm, en partikelmodus på 86,2 nm og en koncentration på 7,4 × 108 partikler / ml. I modsætning hertil havde ufiltrerede prøver en gennemsnitlig partikeldi…

Discussion

Der findes flere metoder til at estimere størrelsen og koncentrationen af nanopartikler¹¹. Disse omfatter ensemblemetoder, der genererer et størrelsesestimat fra en population, herunder dynamisk lysspredning (DLS), centrifugalsedimentering og enkeltpartikelniveauanalyse-elektronmikroskopi, NTA, atomkraftmikroskopi og justerbar resistiv pulssensor. Af disse anvendes DLS og NTA i vid udstrækning, ikke-destruktive størrelses- og koncentrationsmålemetoder baseret på brownsk bevægelse i et ideel…

Materials

Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container