Улучшение воспроизводимости для соответствия минимальной информации для исследований внеклеточных везикул 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis
Summary
Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является широко используемым методом для характеристики внеклеточных везикул. В этой статье освещаются экспериментальные параметры и средства контроля NTA, а также единый метод анализа и характеристики образцов и разбавителей, необходимых для дополнения руководящих принципов, предложенных MISEV2018 и EV-TRACK для воспроизводимости между лабораториями.
Abstract
Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является одним из нескольких методов характеристики, используемых для исследования внеклеточных везикул (EV) с 2006 года. Многие считают, что приборы NTA и их программные пакеты могут быть легко использованы после минимального обучения и что калибровка размера возможна внутри компании. Поскольку как приобретение NTA, так и анализ программного обеспечения представляют собой характеристику EV, они рассматриваются в Минимальной информации для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV2018). Кроме того, они контролировались с помощью прозрачной отчетности и централизации знаний в исследованиях внеклеточных везикул (EV-TRACK) для повышения надежности экспериментов с электромобилями (например, минимизации экспериментальных вариаций из-за неконтролируемых факторов).
Несмотря на усилия по поощрению отчетности о методах и средствах контроля, во многих опубликованных исследовательских работах не сообщается о критических настройках, необходимых для воспроизведения оригинальных наблюдений NTA. В немногих работах сообщается о характеристике NTA отрицательных контрольных или разбавителей, очевидно, предполагая, что коммерчески доступные продукты, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор или сверхчистая дистиллированная вода, не содержат твердых частиц. Аналогичным образом, исследователи редко сообщают о положительных контрольных показателях или стандартах размера для проверки размера частиц. Уравнение Стокса-Эйнштейна включает в себя переменные вязкости и температуры образца для определения смещения частиц. Таким образом, сообщение о стабильной температуре лазерной камеры в течение всего видеосбора образцов является важной контрольной мерой для точной репликации. Фильтрация образцов или разбавителей также обычно не сообщается, и если это так, то редко включаются особенности фильтра (производитель, мембранный материал, размер пор) и условия хранения. Минимальные стандарты допустимых экспериментальных деталей Международного общества внеклеточных везикул (ISEV) должны включать хорошо документированный протокол NTA для характеристики EV. Следующий эксперимент предоставляет доказательства того, что протокол анализа NTA должен быть установлен отдельным исследователем и включен в методы публикаций, которые используют характеристику NTA в качестве одного из вариантов выполнения требований MISEV2018 для характеристики одного пузырька.
Introduction
Точный и воспроизводимый анализ электромобилей и других нанометровых частиц представляет собой многочисленные проблемы в исследованиях и промышленности. Тиражирование исследований EV было затруднено, в частности, из-за отсутствия единообразия в представлении необходимых параметров, связанных со сбором данных. Чтобы устранить эти недостатки, ISEV предложил отраслевые руководящие принципы в качестве минимального набора биохимических, биофизических и функциональных стандартов для исследователей EV и опубликовал их в виде заявления о позиции, обычно называемого MISEV20141. Ускоряющиеся темпы исследований электромобилей потребовали обновленного руководства, и «MISEV2018: заявление о позиции ISEV» расширило руководящие принципы MISEV20142. Документ MISEV2018 включал таблицы, наброски предлагаемых протоколов и шаги, которые необходимо выполнить для документирования конкретных характеристик, связанных с EV. В качестве дополнительной меры для облегчения интерпретации и тиражирования экспериментов EV-TRACK был разработан в качестве базы знаний краудсорсинга (http://evtrack.org), чтобы обеспечить более прозрачную отчетность о биологии EV и методологии, используемой для опубликованных результатов3. Несмотря на эти рекомендации в отношении стандартизированной отчетности о методах, на местах по-прежнему страдают в том, что касается воспроизведения и подтверждения опубликованных результатов.
В соответствии с усилиями Национальных институтов здравоохранения и Национального научного фонда по инструментам оценки качества, в этом документе предполагается, что ISEV требует стандартизированной отчетности о методах и деталях, чтобы инструменты оценки данных могли применяться с целью воспроизведения результатов между лабораториями. Отчетность об источниках клеток, процедурах культивирования клеток и методах изоляции EV являются важными факторами для определения качеств популяции EV. Среди приборов NTA такие факторы, как настройки обнаружения, показатель преломления жидкости-носителя, гетерогенные популяции частиц, способствующие полидисперсности, отсутствие стандартизированных требований к отчетности и отсутствие результатов измерений внутри и между наблюдателями, затрудняют или делают невозможным сравнение NTA между лабораториями.
Используемый с 2006 года, NTA является популярным методом определения размера наночастиц и концентрации, который в настоящее время используется примерно 80% исследователей EV4. Руководящие принципы MISEV2018 требуют двух форм анализа с одним пузырьком, одним из популярных вариантов которого является NTA. NTA по-прежнему широко используется для характеристики электромобилей из-за его широкой доступности, низкой стоимости за образец и его простой теории основания (уравнение Стокса-Эйнштейна). Оценка EV NTA генерирует оценку распределения и концентрации частиц по размеру с использованием лазерного рассеяния света и броуновского анализа движения, причем нижний предел обнаружения определяется показателем преломления EV. При использовании образца жидкости известной вязкости и температуры траектории электромобилей отслеживаются для определения их среднеквадратичного смещения в двух измерениях. Это позволяет рассчитать коэффициент диффузии частиц и преобразовать его в сферический эквивалентный гидродинамический диаметр по модифицированному уравнению Стокса-Эйнштейна 5,6,7. Анализ NTA от частицы к частице имеет меньшую интерференцию агломератами или более крупными частицами в гетерогенной популяции EV, чем другие методы характеристики7. В то время как несколько более крупных частиц оказывают минимальное влияние на точность определения размеров, присутствие даже незначительных количеств крупных частиц с высоким рассеянием света приводит к заметному снижению обнаружения более мелких частиц из-за снижения программного обнаружения и отслеживания EV8. В качестве метода измерения NTA обычно считается не смещенным в сторону более крупных частиц или агрегатов частиц, но может разрешать множественные популяции с помощью индивидуального анализа частиц9. Из-за использования рассеяния света частицами одним из ограничений анализа NTA является то, что любые частицы, такие как пыль, пластик или порошок с аналогичными преломлениями и размерными характеристиками по сравнению с EV, не могут быть дифференцированы от фактических EV с помощью этого метода характеристики.
NanoSight LM10 (анализатор размера наночастиц) и LM14 (лазерный модуль) продаются с 2006 года, и хотя были разработаны более новые модели этого прибора, эта конкретная модель встречается во многих основных установках и считается надежной рабочей лошадкой. Обучение необходимо для правильной оптимизации настроек NTA для измерений размера и концентрации с высоким разрешением. Двумя важными настройками, необходимыми для оптимальной видеозаписи, являются (1) уровень камеры и (2) порог обнаружения. Они должны быть установлены оператором на основе характеристик образца. Одним из основных ограничений анализа NTA является рекомендация о концентрациях пробы между 107 и 109 частицами/мл, для достижения этого разбавления пробы может потребоваться10. Растворы, используемые для разбавления, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор, 0,15 М физиологического раствора или сверхчистая вода, редко свободны от частиц размером менее 220 мкм, что может повлиять на измерения NTA. NTA-характеристика растворов, используемых для разбавления, должна выполняться на том же уровне камеры и пороге обнаружения, что и анализируемые образцы наночастиц. Размер и концентрация наночастиц, присутствующих в разбавителях, используемых для разбавления образцов EV, редко включаются в публикации, связанные с NTA-анализом EV.
Этот протокол использует NTA-анализ синтетических EV-подобных липосом, оцениваемых с использованием выбранных уровней камеры, порогов обнаружения и механической фильтрации образцов для анализа систематических эффектов уровня камеры, порога обнаружения или фильтрации образцов на набор данных NTA. Липосомы были синтезированы, как описано в дополнительном файле S1. Синтетические липосомы были использованы в этом эксперименте из-за их однородности размеров, физических характеристик и стабильности при хранении при 4 °C. Хотя фактические образцы электромобилей могли быть использованы, гетерогенность и стабильность электромобилей во время хранения, возможно, усложнили это исследование и его интерпретацию. Сходство в отчетах NTA с (A) липосомами и (B) EV указывает на то, что систематические эффекты, выявленные для липосом в этой статье, вероятно, также будут применяться к характеристике EV (рисунок 1). В совокупности эти результаты подтверждают представление о том, что полная отчетность о критических настройках программного обеспечения и описание обработки образцов, таких как разбавитель, разбавление и фильтрация, влияют на воспроизводимость данных NTA.
Целью данной работы является демонстрация того, что изменение настроек NTA (температура, уровень камеры и порог обнаружения) и подготовка образцов изменяют собранные результаты: получены систематические, значительные различия в размерах и концентрации. Поскольку NTA является одним из популярных вариантов выполнения спецификации характеристик MISEV2018, эти результаты демонстрируют важность отчетности о подготовке образцов и настройках NTA для обеспечения воспроизводимости.
Рисунок 1: Репрезентативные отчеты NTA сравнивают липосомы с EV. (A) Липосомы: нефильтрованный образец, охарактеризованный на NTA 12 марта 2020 года. (B) EV: нефильтрованная выборка, охарактеризованная на NTA 26 августа 2021 года. Сокращения: NTA = анализ отслеживания наночастиц; EV = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько методов оценки размера и концентрации наночастиц11. К ним относятся ансамблевые методы, которые генерируют оценку размера популяции, включая динамическое рассеяние света (DLS), центробежное осаждение и анализ на уровне одной частицы – электронную микро?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана штатом Канзас для Института сравнительной биологии стволовых клеток Среднего Запада (MICSCB), Центром исследований рака Джонсона для MLW и NIH R21AG066488 для LKC. МЖС получил поддержку ГРА от МГМСКБ. Авторы благодарят доктора Сантоша Ариала за предоставление липосом, используемых в этом проекте, и членов лабораторий Вайса и Кристенсона за полезные беседы и обратную связь. Д-р Хонг Хэ благодарит за техническую поддержку. MLW благодарит Бетти Горен Вайс за ее поддержку и советы.
Materials
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
Referências
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -. T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
- Malvern analytical Ltd. . NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
- Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
- Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
- vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
