Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण में बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं 2018 दिशानिर्देशों के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी को पूरा करने के लिए पुनरुत्पादन में सुधार
Summary
Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है जो बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को चिह्नित करता है। यह पेपर एनटीए प्रयोगात्मक मापदंडों और नियंत्रणों के साथ-साथ प्रयोगशालाओं के बीच पुनरुत्पादन के लिए MISEV2018 और EV-TRACK द्वारा प्रस्तावित दिशानिर्देशों के पूरक के लिए आवश्यक नमूनों और डिलुएंट्स के विश्लेषण और लक्षण वर्णन की एक समान विधि पर प्रकाश डालता है।
Abstract
Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) 2006 के बाद से extracellular vesicle (EV) अनुसंधान के लिए उपयोग किए जाने वाले कई लक्षण वर्णन विधियों में से एक रहा है। कई लोग मानते हैं कि एनटीए उपकरणों और उनके सॉफ़्टवेयर पैकेजों को न्यूनतम प्रशिक्षण के बाद आसानी से उपयोग किया जा सकता है और यह आकार अंशांकन इन-हाउस संभव है। जैसा कि एनटीए अधिग्रहण और सॉफ्टवेयर विश्लेषण दोनों ईवी लक्षण वर्णन का गठन करते हैं, उन्हें बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी 2018 (MISEV2018) में संबोधित किया जाता है। इसके अलावा, उन्हें पारदर्शी रिपोर्टिंग और बाह्य कोशिकीय पुटिका अनुसंधान (ईवी-ट्रैक) में ज्ञान को केंद्रीकृत करने द्वारा निगरानी की गई है ताकि ईवी प्रयोगों की मजबूती में सुधार किया जा सके (उदाहरण के लिए, अनियंत्रित कारकों के कारण प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करें)।
विधियों और नियंत्रणों की रिपोर्टिंग को प्रोत्साहित करने के प्रयासों के बावजूद, कई प्रकाशित शोध पत्र मूल एनटीए टिप्पणियों को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण सेटिंग्स की रिपोर्ट करने में विफल रहते हैं। कुछ कागजात नकारात्मक नियंत्रण या डिलुएंट्स के एनटीए लक्षण वर्णन की रिपोर्ट करते हैं, स्पष्ट रूप से यह मानते हुए कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद, जैसे कि फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा या अल्ट्राप्योर आसुत पानी, कण-मुक्त हैं। इसी तरह, सकारात्मक नियंत्रण या आकार मानकों को शायद ही कभी शोधकर्ताओं द्वारा कण आकार को सत्यापित करने के लिए रिपोर्ट किया जाता है। स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण में कण विस्थापन को निर्धारित करने के लिए नमूना चिपचिपाहट और तापमान चर शामिल हैं। पूरे नमूना वीडियो संग्रह के दौरान स्थिर लेजर कक्ष तापमान की रिपोर्टिंग, इसलिए, सटीक प्रतिकृति के लिए एक आवश्यक नियंत्रण उपाय है। नमूनों या डिलुएंट्स के निस्पंदन को भी नियमित रूप से रिपोर्ट नहीं किया जाता है, और यदि हां, तो फ़िल्टर की बारीकियों (निर्माता, झिल्ली सामग्री, छिद्र आकार) और भंडारण की स्थिति शायद ही कभी शामिल होती है। इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ISEV) के स्वीकार्य प्रयोगात्मक विवरण के न्यूनतम मानकों में ईवी के लक्षण वर्णन के लिए एक अच्छी तरह से प्रलेखित एनटीए प्रोटोकॉल शामिल होना चाहिए। निम्नलिखित प्रयोग इस बात का सबूत प्रदान करता है कि एक एनटीए विश्लेषण प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत शोधकर्ता द्वारा स्थापित करने की आवश्यकता है और प्रकाशनों के तरीकों में शामिल किया जाना चाहिए जो एकल पुटिका लक्षण वर्णन के लिए MISEV2018 आवश्यकताओं को पूरा करने के विकल्पों में से एक के रूप में एनटीए लक्षण वर्णन का उपयोग करते हैं।
Introduction
ईवी और अन्य नैनोमीटर-स्केल किए गए कणों का सटीक और दोहराने योग्य विश्लेषण अनुसंधान और उद्योग में कई चुनौतियों को प्रस्तुत करता है। ईवी अनुसंधान की प्रतिकृति मुश्किल रही है, भाग में, डेटा संग्रह से जुड़े आवश्यक मापदंडों की रिपोर्टिंग में एकरूपता की कमी के कारण। इन कमियों को दूर करने के लिए, ISEV ने ईवी शोधकर्ताओं के लिए जैव रासायनिक, बायोफिजिकल और कार्यात्मक मानकों के न्यूनतम सेट के रूप में उद्योग दिशानिर्देशों का प्रस्ताव दिया और उन्हें एक स्थिति बयान के रूप में प्रकाशित किया, जिसे आमतौर पर MISEV20141 के रूप में जाना जाता है। ईवी अनुसंधान की तेज गति के लिए एक अद्यतन दिशानिर्देश की आवश्यकता थी, और “MISEV2018: ISEV का एक स्थिति कथन” ने MISEV2014 दिशानिर्देशों2 का विस्तार किया। MISEV2018 पेपर में टेबल, सुझाए गए प्रोटोकॉल की रूपरेखा, और विशिष्ट ईवी-संबद्ध लक्षण वर्णन को दस्तावेज़ करने के लिए पालन करने के लिए चरण शामिल थे। प्रयोगों की व्याख्या और प्रतिकृति को सुविधाजनक बनाने के लिए एक और उपाय के रूप में, EV-TRACK को एक भीड़-सोर्सिंग नॉलेजबेस (http://evtrack.org) के रूप में विकसित किया गया था ताकि EV जीव विज्ञान की अधिक पारदर्शी रिपोर्टिंग और प्रकाशितपरिणामों के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को सक्षम किया जा सके। विधियों की मानकीकृत रिपोर्टिंग के लिए इन सिफारिशों के बावजूद, फ़ील्ड प्रकाशित परिणामों की प्रतिकृति और पुष्टि करने के बारे में पीड़ित है।
गुणवत्ता मूल्यांकन उपकरणों के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्रयास के साथ फिटिंग, इस पेपर से पता चलता है कि ISEV को तरीकों और विवरणों की मानकीकृत रिपोर्टिंग की आवश्यकता होती है ताकि प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की प्रतिकृति के लक्ष्य के साथ डेटा मूल्यांकन उपकरण लागू किए जा सकें। ईवी आबादी के गुणों को परिभाषित करने के लिए सेल स्रोतों, सेल संस्कृति प्रक्रियाओं और ईवी अलगाव विधियों की रिपोर्टिंग महत्वपूर्ण कारक हैं। एनटीए उपकरणों के बीच, पता लगाने की सेटिंग्स, वाहक तरल पदार्थ का अपवर्तक सूचकांक, पॉलीडिस्पर्सिटी में योगदान देने वाली विषम कण आबादी, मानकीकृत रिपोर्टिंग आवश्यकताओं की कमी, और अनुपस्थित इंट्रा- और इंटर-ऑब्जर्वर माप परिणामों जैसे कारकों ने प्रयोगशालाओं के बीच एनटीए की तुलना को मुश्किल या असंभव बना दिया है।
2006 के बाद से उपयोग में, एनटीए नैनोपार्टिकल आकार और एकाग्रता निर्धारण के लिए एक लोकप्रिय विधि है जो वर्तमान में लगभग 80% ईवीशोधकर्ताओं द्वारा उपयोग की जाती है। MISEV2018 दिशानिर्देशों के लिए एकल-पुटिका विश्लेषण के दो रूपों की आवश्यकता होती है, जिनमें से एनटीए लोकप्रिय विकल्पों में से एक है। एनटीए अपनी व्यापक पहुंच, प्रति नमूना कम लागत, और इसके सीधे संस्थापक सिद्धांत (स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण) के कारण ईवी लक्षण वर्णन के लिए आम उपयोग में बना हुआ है। एनटीए द्वारा ईवी मूल्यांकन लेजर प्रकाश प्रकीर्णन और ब्राउनियन गति विश्लेषण का उपयोग करके एक कण आकार वितरण और एकाग्रता अनुमान उत्पन्न करता है, जिसमें ईवी के अपवर्तक सूचकांक द्वारा निर्धारित पहचान की निचली सीमा होती है। ज्ञात चिपचिपाहट और तापमान के तरल पदार्थ के नमूने का उपयोग करते समय, ईवी के प्रक्षेपवक्रों को दो आयामों में उनके माध्य-वर्ग विस्थापन को निर्धारित करने के लिए ट्रैक किया जाता है। यह कण प्रसार गुणांक की गणना करने और एक संशोधित स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण 5,6,7 द्वारा एक गोले-समतुल्य हाइड्रोडायनामिक व्यास में परिवर्तित करने की अनुमति देता है। एनटीए के कण-से-कण विश्लेषण में लक्षण वर्णन के अन्य तरीकों की तुलना में ईवी की विषम आबादी में agglomerates या बड़े कणों द्वारा कम हस्तक्षेपहोता है। जबकि कुछ बड़े कणों का आकार सटीकता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है, बड़े, उच्च प्रकाश-प्रकीर्णन कणों की भी मिनट की मात्रा की उपस्थिति के परिणामस्वरूप कम सॉफ़्टवेयर ईवी का पता लगाने और ट्रैकिंग 8 के कारण छोटे कणों का पता लगाने में उल्लेखनीय कमी आतीहै। एक माप तकनीक के रूप में, एनटीए को आम तौर पर बड़े कणों या कणों के समुच्चय की ओर पक्षपाती नहीं माना जाता है, लेकिन व्यक्तिगत कण विश्लेषण9 के माध्यम से कई आकार की आबादी को हल कर सकता है। कणों द्वारा प्रकाश-प्रकीर्णन के उपयोग के कारण, एनटीए विश्लेषण की सीमाओं में से एक यह है कि ईवी की तुलना में समान अपवर्तन और आकार विशेषताओं के साथ धूल, प्लास्टिक या पाउडर जैसे किसी भी कण को लक्षण वर्णन की इस विधि द्वारा वास्तविक ईवी से अलग नहीं किया जा सकता है।
NanoSight LM10 (nanoparticle आकार विश्लेषक) और LM14 (लेजर मॉड्यूल) 2006 के बाद से बेचा गया है, और हालांकि इस उपकरण के नए मॉडल विकसित किए गए हैं, यह विशेष मॉडल कई मुख्य सुविधाओं में पाया जाता है और इसे एक विश्वसनीय वर्कहॉर्स माना जाता है। आकार और एकाग्रता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन माप के लिए एनटीए सेटिंग्स को ठीक से अनुकूलित करने के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इष्टतम वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक दो महत्वपूर्ण सेटिंग्स (1) कैमरा स्तर और (2) पहचान सीमा हैं। इन्हें नमूने की विशेषताओं के आधार पर ऑपरेटर द्वारा सेट किया जाना चाहिए। एनटीए विश्लेषण की प्रमुख बाधाओं में से एक 107 और 109 कणों / एमएल के बीच नमूना सांद्रता की सिफारिश है, इस नमूने को प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकतीहै। कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान, जैसे कि फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा, 0.15 एम खारा, या अल्ट्राप्योर पानी, शायद ही कभी आकार में 220 μm से कम कणों से मुक्त होते हैं, जो एनटीए माप को प्रभावित कर सकते हैं। कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों के एनटीए लक्षण वर्णन को उसी कैमरा स्तर पर किया जाना चाहिए और नैनोपार्टिकल नमूनों के रूप में पता लगाने की सीमा का विश्लेषण किया जाना चाहिए। ईवी नमूना कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिलुएंट्स में मौजूद नैनोकणों के आकार और एकाग्रता को शायद ही कभी ईवी के एनटीए विश्लेषण से जुड़े प्रकाशनों में शामिल किया जाता है।
यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक ईवी-जैसे लिपोसोम के एनटीए विश्लेषण का उपयोग करता है, जिसका मूल्यांकन चयनित कैमरा स्तरों, डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड और नमूनों के यांत्रिक फ़िल्टरिंग का उपयोग करके किया जाता है ताकि एनटीए डेटासेट पर कैमरा स्तर, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड या नमूना निस्पंदन के व्यवस्थित प्रभावों का विश्लेषण किया जा सके। Liposomes के रूप में पूरक फ़ाइल S1 में वर्णित संश्लेषित किए गए थे. सिंथेटिक लिपोसोम का उपयोग इस प्रयोग में उनके आकार की एकरूपता, भौतिक विशेषताओं और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण में स्थिरता के कारण किया गया था। यद्यपि ईवी के वास्तविक नमूनों का उपयोग किया जा सकता था, भंडारण के दौरान ईवी की विषमता और स्थिरता ने इस अध्ययन और इसकी व्याख्या को जटिल बना दिया हो सकता है। (ए) लिपोसोम और (बी) ईवी से एनटीए रिपोर्टों में समानताएं इंगित करती हैं कि इस पेपर में लिपोसोम के लिए प्रकट किए गए व्यवस्थित प्रभाव संभवतः ईवी लक्षण वर्णन (चित्रा 1) पर भी लागू होंगे। साथ में, ये निष्कर्ष इस धारणा का समर्थन करते हैं कि महत्वपूर्ण सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स की पूरी रिपोर्टिंग और नमूना प्रसंस्करण का विवरण, जैसे कि डिल्यूएंट, कमजोर पड़ने और निस्पंदन, एनटीए डेटा की पुनरुत्पादकता को प्रभावित करते हैं।
इस पेपर का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि एनटीए सेटिंग्स (तापमान, कैमरा स्तर, और पता लगाने की सीमा) और नमूना तैयारी में बदलाव के परिणामों को बदलना है: आकार और एकाग्रता में व्यवस्थित, महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त किए गए थे। जैसा कि एनटीए MISEV2018 लक्षण वर्णन विनिर्देश को पूरा करने के लिए लोकप्रिय विकल्पों में से एक है, ये परिणाम पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए नमूना तैयारी और एनटीए सेटिंग्स की रिपोर्टिंग के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।
चित्रा 1: प्रतिनिधि एनटीए रिपोर्ट करने के लिए लिपोसोम की तुलना करने के लिए EVs. (ए) लिपोसोम्स: 12 मार्च 2020 को एनटीए पर अनफ़िल्टर्ड नमूना की विशेषता है। (बी) ईवी: 26 अगस्त 2021 को एनटीए पर अनफ़िल्टर्ड नमूना विशेषता है। संक्षेप: NTA = Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण; EVs = extracellular vesicles. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
नैनोकणों के आकार और एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। इनमें पहनावा विधियां शामिल हैं जो एक आबादी से आकार का अनुमान उत्पन्न करती हैं, जिसमें गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस),…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को तुलनात्मक स्टेम सेल जीवविज्ञान (MICSCB) के लिए मिडवेस्ट इंस्टीट्यूट, जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर को तुलनात्मक स्टेम सेल जीवविज्ञान (MICSCB) के लिए कंसास राज्य द्वारा समर्थित किया गया था, जो MLW और एनआईएच R21AG066488 को LKC के लिए था। OLS को MICSCB से GRA समर्थन प्राप्त हुआ। लेखकइस परियोजना में उपयोग किए जाने वाले लिपोसोम और सहायक वार्तालापों और प्रतिक्रिया के लिए वीस और क्रिस्टनसन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को प्रदान करने के लिए डॉ संतोष आर्यल को धन्यवाद देते हैं। डॉ हांग वह तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है। MLW उसके समर्थन और वकील के लिए Betti Goren Weiss धन्यवाद.
Materials
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
Referências
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