Summary
本プロトコルは、適度な速度で走行しているトレッドミル中に発生するげっ歯類の頭部での機械的加速度を再現する、カスタム設計された「パッシブヘッドモーション」システムについて説明しています。それは身体運動の有益な効果から機械的要因/要素を解剖することを可能にします。
Abstract
運動は、脳機能障害に関連するものを含むさまざまな病気や身体障害に効果的であると広く認識されています。しかし、運動の有益な効果の背後にある分子メカニズムはよくわかっていません。多くの身体トレーニング、特にジョギングやウォーキングなどの有酸素運動に分類されるトレーニングは、地面との足の接触時に衝動的な力を生み出します。したがって、運動が生物の恒常性にどのように寄与するかには、機械的影響が関係しているのではないかと推測されました。この仮説を脳で検証するために、制御され定義された大きさとモードで垂直加速度を生成し、中程度の速度で走るトレッドミル中にげっ歯類の頭に適用される可能性のある機械的刺激を再現できるカスタム設計された「パッシブヘッドモーション」(以下、PHMと呼びます)システムが開発されました動物における運動の効果をテストするための典型的な介入。このシステムを使用することにより、PHMがマウスの前頭前野(PFC)ニューロンにおけるセロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、以下、5-HTと呼ぶ)受容体サブタイプ2A(5-HT2A)シグナル伝達を再現することが実証されました。この研究は、PHMを適用し、げっ歯類の頭で結果として生じる機械的加速度を測定するための詳細なプロトコルを提供します。
Introduction
運動は、糖尿病や本態性高血圧症などの生活習慣病を含むいくつかの身体障害を治療または予防するのに有益です1。これに関連して、運動が脳機能に及ぼすプラスの効果に関する証拠も蓄積されています2。しかし、脳にとっての運動の利点の根底にある分子メカニズムは、主に未解明のままです。ほとんどの身体活動やトレーニングは、少なくともある程度は、頭に機械的加速を生成します。さまざまな生理学的現象が機械的に制御されているのに対し、機械的負荷の重要性は、ほとんどの場合、筋骨格系で文書化されています3,4,5。脳は身体活動、特にいわゆる衝撃運動中にも機械的な力を受けますが、生理学的脳機能の機械的調節はほとんど研究されていません。頭部での機械的加速度の生成は身体的なトレーニングに比較的一般的であるため、機械的調節は脳機能に対する運動の利点に関係している可能性があると推測されています。
5-HT2A受容体シグナル伝達は、神経系で機能する様々な生化学的シグナルの中でも感情や行動を調節するのに不可欠です。それは複数の精神疾患に関与しています6,7,8、運動は治療的に効果的であることが証明されています。5-HT2A受容体は、セロトニンファミリーに属する5-HT2受容体のサブタイプであり、Gタンパク質共役受容体(GPCR)ファミリーのメンバーでもあり、そのシグナル伝達は、リガンド依存性または非依存性のいずれかのその内在化によって調節される9。頭部のけいれんはげっ歯類の特徴的な行動であり、その量(頻度)は、前頭前野(PFC)ニューロンにおける5-HT2A受容体シグナル伝達の強度を明示的に表しています10,11。投与された5-HT(頭筋反応、以下HTRと呼ぶ;補足動画1を参照)に対するこの幻覚反応の厳密な特異性を利用して、脳機能に対する運動効果の機械的影響に関する上記の仮説が検証されました。したがって、強制運動(トレッドミルランニング)または運動模倣機械的介入(PHM)のいずれかを受けたマウスのHTRを解析および比較しました。
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Protocol
すべての動物実験は、国立障害者リハビリテーションセンターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。8〜9週齢の雄のSprague-Dawleyラットを使用して、トレッドミルランニングおよびPHM中の頭部での加速度を測定しました。9〜10週齢の雄C57BL / 6マウスを、PFCの行動試験および組織学的分析に使用しました。 動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。
1.トレッドミル走行中のx、y、z軸に沿った加速度の大きさの測定
- 1.5%イソフルランを吸入してラットを麻酔する。
注:ラットは、実験室環境に少なくとも1週間順応した後に使用されました。ラットが後肢のつま先のつまみに反応しないことを確認してください。 - サージカルテープを使用して、加速度計( 材料の表を参照)をラットの頭の上に固定します。
- 麻酔から完全に回復したら、ラットをトレッドミルマシンに入れ( 材料の表を参照)、トレッドミルを中程度の速度(20 m / min)に調整します12 (図1A)。
注:イソフルラン吸入の終了後、ラットの麻酔からの完全な回復を確認し、トレッドミル実験を開始するのに少なくとも20分かかりました。ラットが後肢のつま先のつまみに反応し、明らかなよろめきなしに歩いたり走ったりできることを確認してください。 - 製造元の指示に従って、アプリケーションソフトウェアを使用して、ラットトレッドミルの走行中の垂直加速度の大きさを測定します(材料表を参照)。
注:10個のシリアル波を抽出し、3次元軸(x、 y、 z軸、 図1B)に沿った平均加速度を個別に計算します。ピークの大きさは、ステッピング同期波(~2 Hz周波数)をトレッドミル走行誘発加速度として定義することによって定量化されました(図1C)。ラットは、マウスでは不可能であった頭部の垂直加速度を確実に測定するのに、体のサイズが大きいため、この研究に使用されました。しかし、マウスは、頭のけいれん反応の定量的分析に関する容易さと信頼性のために、さらなる研究に使用されました。
2. PHMシステムの調整とマウスへのPHMの適用
- プラットフォームの振動の振幅とPHMシステムでのプロペラ型カムの回転速度を事前に設定し(図1D)、垂直加速度の大きさと周波数がステップ1.4で取得した値と一致するようにします。
注意: PHMシステムは、金属製のフレームワークと木製のプラットフォームで構成されています。モーター速度は、内蔵ドライバーに接続されているダイヤルを調整することで変更および制御できます( 材料表を参照)。600のダイヤルスケールは2Hzに相当します( 図1E)。プロペラ型のカムには、ステップ高さ5 mmの4つのブレードがあります(図1F)。 - 1.2%イソフルランの吸入 を介して マウスを麻酔する。
注:マウスは、実験室環境に少なくとも1週間順応した後に使用されました。マウスが後肢のつま先のつまみに反応しないことを確認します。 - マウスを腹臥位に置き、頭と体の残りの部分をそれぞれ振動可能なプラットフォームと静的なプラットフォームに配置します。
注:マウスを麻酔したままにします(1.2%イソフルラン)。 - モーターをオンにしてプラットフォームを垂直に振動させ、PHMをマウスに適用します。
注意: モーター速度は、プラットフォームを2Hzで振動するように調整されました(手順2.1を参照)。同様に麻酔をかけ、コントロールマウスをPHMプラットフォームに配置しますが、モーターはオフのままにします。
3.トレッドミルでのマウスの実行
- マウスをトレッドミルマシンに置き、トレッドミリングを適度な速度(10 m / min)に調整します13。
4. マウス頭筋反応(HTR)の定量化
- ビデオカメラ(フレームレート:24fps)をセットアップして、透明なプラスチックケース内の空間全体を記録します。
注意: プラスチック製のケージは、ビデオ録画の分野でマウスを維持するために使用されました。 - 5-HTの前駆体である5-ヒドロキシトリプトファン(5-HTP)(100 mg / kg)( 材料の表を参照)をマウスに腹腔内投与します。.
- マウスを透明なケージに入れ、30分間記録を開始します。
- 録画したビデオ(1/2倍または1/3倍の速度)を確認し、頭のけいれんを手動でカウントします。
注:アナリストは実験手順を知らされていませんでした。マウスの特徴的な「チック様」な急速な動き( 補足動画1を参照)は、通常の繁殖環境ではめったに起こらない頭のけいれんとしてカウントされました。
5. マウスPFCの免疫組織化学的解析
- HTR検査が完了したら、ミダゾラム(4.0 mg / kg)、ブトルファノール(4.0 mg / kg)、およびメデトミジン(0.3 mg / kg)の混合物を投与してマウスを麻酔し、PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を灌流し、以前に発表された報告に従って脳を切除します14,15。
- 脳をPBS中の4%PFAに4°Cでさらに24時間後固定し、沈むまで30%ショ糖/ PBSに保存します。固定された最適な切削温度コンパウンド(OCTコンパウンド、 材料表を参照)を凍結します。
- スライドボックスからマウス脳の凍結切片を取得します( 材料表を参照)。サンプルが完全に脱水するまで、スライドを室温で清潔なワイプの上に置いておきます。
注:厚さ20マイクロメートルの矢状切片(横方向+ 0.5〜1.5 mm)は、クライオスタットを使用してOCT化合物に埋め込まれた凍結サンプルから調製されました(材料の表を参照)。 - 液体ブロッカーペン( 材料表を参照)を使用して、スライド上の凍結切片組織の周りに円を描き、溶液の拡散領域を閉じ込めます(トリス緩衝生理食塩水(TBS-T)中の0.1%Tween-20)。
- 湿らせたワイプをスライドを保持するトレイの下部に置いて、湿った環境を作り出します。
- TBS-Tによる透過処理後、室温で4%ロバ血清( 材料の表を参照)で1時間ブロックします。
- スライドをTBS-Tに5分間浸して1回すすぎます。
- 100 μLの適切に希釈された一次抗体とDAPI( 材料の表を参照)ミックスを各スライドに塗布し、サンプルの乾燥を避けるためにトレイを覆い、室温で一晩インキュベートします。
- TBS-Tで3回すすぎます(各5分間インキュベート)。
- 適切に希釈した種マッチング蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488、568、または645と結合)100 μLを各スライドに塗布し( 材料の表を参照)、室温で1時間インキュベートします。
- TBS-Tで3回すすぎます(各5分間インキュベート)。
- スライドを封入剤で取り付けます( 材料表を参照)。スライドをカバーガラスで覆います。
- 蛍光顕微鏡でサンプルを表示します。
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Representative Results
中程度の速度(20 m / min)で走行しているトレッドミル中のラットの頭部での垂直加速度のピークの大きさは約1.0 × g でした(図1C)。PHMシステム(図1D)は、げっ歯類の頭部に1.0 × g の垂直加速度ピークを生成するように設定されました。
マウスへのPHM適用(2 Hz、30分/日で7日間)は、対照マウス(PHMなしで30分/日、7日間毎日麻酔をかけた)と比較して、HTRが大幅に減弱しました(図2)。これは、PFCニューロンにおける5-HT2A受容体シグナル伝達に対するPHMの抑制効果を表す。
トレッドミルランニングとPHMは、マウスPFCニューロンにおける5-HT2A 受容体のインターナリゼーションを有意に増強しました(図3)。一貫して、トレッドミルランニングおよびPHMの両方が、マウスPFCニューロンにおける5−HTP誘導性c−Fos発現、5−HT2A 受容体活性化14の下流細胞事象を下方制御した(図4)。これらの結果は、トレッドミルランニングとPHMがPFCニューロンの5-HT2A 受容体をインターナリゼーションし、関連するシグナル伝達を減弱させることを示唆しています。
図1:トレッドミル走行中の加速度の大きさの測定 。 (A)トレッドミル走行中にラットの頭部に発生する加速度を測定するための図。(B)本研究で用いたx軸(左右)、y軸(吻側尾側)、z軸(背腹側)の定義。(C)加速度は、20 m / minおよびPHM(周波数:2 Hz)で走行しているトレッドミル中にラットの頭部で発生しました(各グループでn = 3匹)。PHMシステムは、20 m/minのトレッドミル走行時(1.0 × g)と同等の垂直加速度ピークを生成するように調整されました。直角スケールバー、0.5 × g / 0.5秒。画像は、同様の結果を持つ3つの独立した実験を表しています。(D)PHMシステム全体の写真。€ ドライバー付きモーターに接続されたプロペラ型カムの写真。(F)ステップ高さ5mmの4枚のブレードからなるプロペラ型カムの写真(赤矢印の両矢印参照)。この図はRyuら15から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスへのPHMの適用 。 (A)HTRに対するPHMの効果の分析のための説明図。(B,C)PHMは5-HTP誘発HTRを軽減した。頭部のけいれんは、5-HTP投与後5分ブロック(B)および30分ブロック(C)でカウントした。対照2は、麻酔をかけ、振動させないままPHMプラットフォーム上に配置したマウスを表す。データは、SEM.*、 P <0.05、対応のない t検定(各群につきn = 10匹のマウス)±手段として提示される。この図はRyuら15から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:トレッドミルランニングおよびPHMアプリケーションは、マウスPFCニューロンにおける5-HT2A受容体インターナリゼーションを強化した。 (A)1週間の毎日のPHMの後に5-HTP(またはビヒクル)を注射したマウスのPFCの抗5-HT2A受容体(5-HT2A R;赤)および抗NeuN(緑)免疫染色の顕微鏡写真。矢印が向いた細胞の抗5-HT2A受容体免疫染色の高倍率画像をグレースケールで示す。黄色の線はNeuN陽性シグナルで概説された体細胞マージンを示し、シアンの矢印は内在化された抗5-HT2A受容体免疫シグナルを示しています。スケールバー、20μm。画像は5匹のマウスを代表するものである。(B)マウスPFCニューロンにおける5-HT2A受容体インターナリゼーションの定量。インターナライズおよび膜関連5-HT2A受容体陽性領域を、マウスPFCにおけるNeuN陽性領域に対する値として定量化した。 コントロール1は、電源を切ったままのトレッドミルマシンに置かれたマウスを表し、コントロール2は、麻酔をかけられ、振動しないままPHMプラットフォーム上に置かれたマウスを表す。各マウスについて35〜40個のNeuN陽性ニューロンソーマを分析しました(内在化:左のチャート、p < 0.001、ポストホックボンフェローニ検定による一元配置分散分析、右のチャート、P = 0.0027、対応のないt検定;膜関連:左チャート、P < 0.001、ポストホックボンフェローニ検定による一元配置分散分析。右のチャート、P = 0.0025、対応のないt検定。n=各群5匹)。データはSEM±平均値として表されます。 **P < 0.01, ***P < 0.001;NS、重要ではありません。この図はRyuら15から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:トレッドミルランニングとPHMアプリケーションは、マウスPFCニューロンにおける5-HTP誘導性c-Fos発現を下方制御しました。 (A)1週間のPHMの1週間後に5-HTP(またはビヒクル)を腹腔内投与したマウスのPFCの抗c-Fos(緑)、抗5-HT2A受容体(赤)、および抗NeuN(青)免疫染色の顕微鏡写真。スケールバー、100μm。画像は4〜5匹のマウスを代表するものである。(B)マウスPFCにおける5-HT2A受容体陽性ニューロンにおけるc-Fos発現の定量。 対照1は、電源を切ったままのトレッドミルマシンに置かれたマウスを表し、対照2は、麻酔をかけられ、振動せずに放置されたPHMプラットフォーム上に置かれたマウスを表す。300個のNeuNおよび5-HT2A受容体陽性細胞のc-Fos陽性細胞の相対集団(%)を示す(左のグラフ:P < 0.001 、ポストホックボンフェローニ検定による一元配置分散分析;右のグラフ:P < 0.001、対応のないt検定;列1はn = 4マウス、列2〜5はn = 5マウス)。データはSEM±平均値として表されます。 ***P < 0.001。この図はRyuら15から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足動画1:マウスからの頭のけいれん反応。 2分46秒のムービーは、HTPインジェクションの6分後に始まります。頭のけいれんは、0:03、0:39、1:39、および2:42の時点で観察されます。この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
開発したPHM応用システムを用いて、PFCニューロンの5-HTシグナル伝達が機械的に制御されていることを示しました。運動効果は複雑であるため、健康増進の文脈で運動の結果を正確に分析することは困難でした。焦点は、エネルギー消費などの運動活動に伴って、またはその後に発生する可能性のある代謝イベントの関与または寄与を排除するための機械的側面にあります。ここで説明した方法は、脳機能に対する運動効果の根底にあるメカニズムを探る生物医学研究において、より広く有用であると期待されています。
現在のシステムでは、実験動物をPHMにさらすために麻酔が必要であり、これは脳内の神経細胞の行動やプロセスに影響を与える可能性があります(有害であるかどうかにかかわらず)。PHMによって生成される機械的加速度の大きさ、モード、波形など、システムを変更することにより、麻酔なしでPHMを適用できる場合があります。例えば、現在のPHMの1× g の衝動的なピークの代わりに正弦波を伴うより小さな加速ピークは、動物によるより快適な刺激として「感じられる」可能性がある。あるいは、実験動物を最小限のストレスで振動プラットフォーム上に保持するための新しい方法を実装することができます。これらの変更と改善は、主にPHMによって生成された加速が原則として中程度の運動に関連しており、実験動物にとって「痛みを伴う」ストレスになる可能性が低いため、実行可能です。
多くの以前の研究では、多くの病気や障害を治療または予防するための効果的な手順として適度な運動が報告されています16,17。ストレス指標18である副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)の分泌に伴って血漿乳酸濃度が指数関数的に増加する乳酸閾値は、軽度または中等度の運動を決定するために使用されます19。ただし、「最適な」運動は分子レベルで定義されていません。脳だけでなく、最終的には他のすべての身体器官が運動中に機械的な力を受けるため、機械的摂動を用いた現在のアプローチは、より広い文脈で運動効果の背後にある分子メカニズムを明らかにし、科学的手段によって「最適な運動とは何か」を定義するのに役立つ可能性があります。
ただし、現在の方法には特定の制限があります。加速度センサーをマウスヘッドに安定して固定できなかったのは、サイズの互換性がないためです。予備測定では、マウスヘッドでのトレッドミル走行によって生成された機械的加速度のピークマグニチュードも約1.0 × gであることが示されていますが、より正確に定量化するにはさらなる研究が必要です。
本プロトコルは、身体運動から機械的要素/要因を解剖することを可能にするカスタム設計されたPHMシステムの手順を詳述している。このアプローチは、脳機能に対する運動の利点に関する重要な洞察を提供します。
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Disclosures
著者らは、この論文で説明されている作業に関連する競合する利益はないと宣言します。
Acknowledgments
この作業の一部は、日本の厚生労働省の学内研究費の支援を受けました。日本学術振興会科学研究費助成事業 (科学研究費助成事業 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367);文部科学省 文部科学省 戦略的研究財団 2015-2019 (S1511017)内藤科学技術振興財団.この研究はまた、Eunice Kennedy Shriver国立小児保健人間発達研究所(NICHD)、国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)、および国立衛生研究所の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)の支援を受けているAlliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training(AR3T)からも資金提供を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
References
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