Summary
Мы представляем процесс выделения, размножения и характеристики бактерий, разлагающих углеводороды, из водной среды обитания. Протокол предусматривает выделение бактерий, идентификацию методом 16S рРНК и тестирование их способности к разложению углеводородов. Эта статья поможет исследователям в характеристике микробного биоразнообразия в образцах окружающей среды и, в частности, в скрининге микробов с потенциалом биоремедиации.
Abstract
Углеводородные загрязнители не поддаются разложению, а их накопление в окружающей среде токсично для всех форм жизни. Бактерии кодируют многочисленные каталитические ферменты и естественным образом способны метаболизировать углеводороды. Ученые используют биоразнообразие водных экосистем для изоляции бактерий с потенциалом биоразложения и биоремедиации. Такие изоляты из окружающей среды обеспечивают богатый набор метаболических путей и ферментов, которые в дальнейшем могут быть использованы для масштабирования процесса разложения в промышленных масштабах. В этой статье мы опишем общий процесс выделения, размножения и идентификации видов бактерий из водной среды обитания и проверим их способность использовать углеводороды в качестве единственного источника углерода in vitro с помощью простых методов. Настоящий протокол описывает выделение различных видов бактерий и их последующую идентификацию с помощью анализа 16S рРНК. В протоколе также представлены шаги по характеристике потенциала бактериальных изолятов по разложению углеводородов. Этот протокол будет полезен исследователям, пытающимся изолировать виды бактерий из среды обитания для их биотехнологических применений.
Introduction
Углеводороды (УВ) широко используются как в качестве топлива, так и в химической промышленности. Ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол, широко используются в качестве растворителей1. Алкены, такие как этилен и пропилен, служат прекурсорами в синтезе полимеров полиэтилена и полипропилена соответственно. При полимеризации другого углеводорода, стирола, образуется полистирол. Антропогенная деятельность вносит углеводороды в окружающую среду при их добыче и транспортировке. Углеводородное загрязнение почвы и воды вызывает серьезные опасения для окружающей среды и здоровья человека. Микробы играют важную роль в поддержании экосистемы, регулируя биогеохимические циклы и используя широкий спектр субстратов, которые также включают загрязняющие вещества и ксенобиотики, превращая их в углерод и источник энергии. Этот процесс детоксикации загрязнителей окружающей среды микроорганизмами известен как биоремедиация 3,4,5,6,7.
Микроорганизмы, способные разлагать углеводороды, обнаружены в водных и почвенных средахобитания 8,9,10. Было идентифицировано множество бактерий, способных разлагать алканы и ароматические HC, такие как Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter и Oleibacter11. Разработка технологически продвинутых подходов, не зависящих от культуры, помогла обнаружить новые микробные сообщества, разрушающие HC12. Геномный материал, непосредственно выделенный из исходных образцов, амплифицируется и секвенируется с помощью высокопроизводительных методов, таких как секвенирование нового поколения (NGS), с последующим анализом, исключающим необходимость культивирования микроорганизмов. Методы NGS, такие как метагеномный анализ, являются дорогостоящими и страдают недостатками, связанными с процессом амплификации13. Методы культивирования, такие как селективное обогащение культуры14, нацеленные на изоляцию микробов, разлагающих углеводороды, по-прежнему полезны, поскольку они позволяют исследователям исследовать и манипулировать метаболическими путями в бактериальных изолятах.
Выделение геномной ДНК и последующее секвенирование геномного материала позволяет получить ценную информацию о любом организме. Полногеномное секвенирование помогает идентифицировать гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам, потенциальные мишени для лекарств, факторы вирулентности, транспортеры, ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, и т. д.15,16,17. Было доказано, что секвенирование гена, кодирующего 16SrРНК, является надежным методом идентификации филогении бактерий. Сохранение последовательности и функции гена на протяжении многих лет делает его надежным инструментом для идентификации неизвестных бактерий и сравнения изолята с ближайшими видами. Кроме того, длина этого гена оптимальна для биоинформатического анализа18. Все эти особенности, наряду с простотой амплификации генов с помощью универсальных праймеров и совершенствованием технологии секвенирования генов, делают его золотым стандартом для идентификации микробов.
В данной статье мы опишем процедуру извлечения культивируемых микроорганизмов с потенциалом разложения HC из образцов окружающей среды. Метод, описанный ниже, описывает сбор и идентификацию HC-разлагающих бактерий и разделен на пять разделов: (1) сбор бактерий из проб воды, (2) выделение чистых культур, (3) изучение способности бактериальных изолятов к деградации HC, (4) выделение геномной ДНК и (5) идентификация на основе секвенирования гена 16S рРНК и анализа BLAST. Эта процедура может быть адаптирована для выделения бактерий для различных биотехнологических применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор, обработка и анализ проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы представляем протокол по изоляции бактерий из водной среды обитания. Некоторые из изолятов могут быть патогенными, поэтому надевайте перчатки и дезинфицируйте рабочую зону до и после использования.
- Соберите 500 мл пробы воды в пять стерильных стеклянных флаконов с разных участков водоема. Измерьте рН и температуру каждого образца с помощью рН-метра и термометра соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол не привязан к конкретному месту и может быть легко адаптирован для изоляции организмов из водоемов, загрязненных углеводородами. - Отфильтруйте образец в партии по 100 мл через фильтрующие листы с размером пор 0,22 мкм в асептических условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр фильтровальной бумаги не должен превышать диаметр чашки Петри. Например, фильтровальная бумага диаметром не более 85 мм оптимальна для чашки Петри диаметром 100-120 мм. - Храните фильтровальную бумагу на различных пластинах питательных сред (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 иM2G 22). Различные типы питательных сред позволяют отбирать и обогащать различные микроорганизмы. Составы различных питательных сред приведены в таблице 1. Используйте по одной бумаге для каждой пластины носителя и отклейте через 2 ч с помощью стерильных щипцов.
- Последовательно разбавляют нефильтрованную пробу воды (10-6 разведение) в стерильной воде двойной дистилляции, добавляя 100 мкл собранной пробы воды в 900 мкл стерильной воды. В результате получается разбавление 1:10. Из этого образца берут 100 мкл и добавляют 900 мкл стерильной воды до получения разведения 1:100. Повторяйте разбавление до тех пор, пока разбавление не станет 1:1 000 000. Смешать пипеткой. Окончательный объем каждого разведения составит 1 мл.
- Распределите 100 мкл разбавленного образца воды по отдельности на все планшеты питательной среды, упомянутые в шаге 3, в трех экземплярах.
- Инкубируют планшеты при 30 °C в течение 24–48 ч в зависимости от роста колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство изолятов окружающей среды растут при оптимальной температуре 30 °C. Если вы изолируете образцы от среды с экстремальными температурами, инкубируйте планшеты при той же температуре, что и в месте сбора. - Затем соберите колонии стерильной зубочисткой или наконечником пипетки и выполните полоску квадранта, чтобы получить изолированные колонии.
- Выдерживайте пластины в течение ночи. На следующий день проведите скрининг колоний на основе их морфологических особенностей, таких как цвет, текстура, форма, размер, края, высота и т. д. Размножайте колонии, чтобы получить чистые культуры.
- Проводят грам-окрашивание каждой чистой культуры23 и приступают к приготовлению глицеринового исходного материала.
- Для приготовления запасов глицерина инокулируют одну колонию в 3 мл соответствующей питательной среды и инкубируют при 30 °C. Из ночной культуры берут 700 мкл и добавляют 300 мкл 100% глицерина (стерилизованного автоклавированием) в криовиалы24. Заморозьте флаконы при температуре -80 °C для длительного хранения.
2. Деградация углеводородов
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже пример предназначен для скрининга изолятов, которые могут разлагать стирол. Он представляет собой незначительную модификацию метода, адаптированного в предыдущем докладе25. Следуйте инструкциям в асептических условиях.
- Из тарелки со свежими прожилками выберите колонию и инокулируйте 5 мл триптического соевого бульона (TSB)/питательного бульона (NB). Выращивайте культуру в течение ночи при 30 °C с встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока поглощение не достигнет ~2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме TSB/NB, можно выбрать любую питательную среду, в которой бактерии достигают высокой плотности клеток. - На следующий день гранулируйте клетки при 2862 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
- Дважды промойте гранулы 2 мл автоклавного физиологического раствора (0,9% NaCl) и отжим при 2862 x g в течение 5 минут при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологический раствор является изотоническим и, таким образом, поддерживает осмотическое давление внутри бактериальных клеток. - Ресуспендировать гранулу в 2 мл жидкой безуглеродной базальной среды (LCFBM). Измерьте абсорбцию (OD600).
- Возьмите две стерильные колбы Эрленмейера емкостью 150 мл для контроля и опытной группы. Обозначьте их как A и B.
- В непривитой/контрольной группе (колба А) добавьте 40 мл LCFBM и стирола (5 мМ).
- В колбу Б добавьте по 35 мл LCFBM и стирола (конечную концентрацию стирола доведите до 5 мМ). Добавьте клеточную суспензию с окончательным наружным диаметром600 ячеек ≈ 0,1 и дополните оставшийся объем LCFBM до 40 мл. Инкубируют колбы при температуре 30 °C при встряхивании при 200 об/мин в течение 30 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Углеводороды в избытке могут быть токсичными для микробов, поэтому начинайте с низкой концентрации и постепенно увеличивайте ее. - Повторите вышесказанное для каждого дополнительного штамма, который необходимо оценить на разложение углеводородов.
- Измеряйте наружный диаметр600 каждой колбы каждые 5 дней и стройте кривую роста. Увеличьте инкубацию до 45 дней, если бактерии могут использовать стирол. Увеличение OD600 указывает на то, что бактерия может метаболизировать стирол.
3. Скрининг разложения катехин бактериальными изолятами
ПРИМЕЧАНИЕ: При разложении ароматических углеводородов, таких как стирол, бензол, ксилол, нафталин, фенолы и т. д., образуются катехины в качестве промежуточных продуктов реакции. Катехины далее метаболизируются бактериями с помощью ферментов катехин-1,2-диоксигеназы и катехин-2,3-диоксигеназы через орто- и мета-пути расщепления, соответственно26. Эти ферменты также участвуют в разложении других углеводородов, таких как хлорбензол27. Протокол, упомянутый ниже, использует лизат цельных клеток для анализа фермента катехола 2, 3-диоксигеназы28. Этот же метод лизиса может быть использован для скрининга активности катехин-1,2-диоксигеназы. Однако состав реакционной смеси будет отличаться. Оба фермента являются индуцируемыми по своей природе и могут быть индуцированы добавлением фенола в питательную среду.
- С помощью стерильной петли посев бактериальной колонии со свежепрожилочной пластины в среду минеральных солей (МСМ) с добавлением 1-4 мМ фенола. Инкубируют культуру при температуре 30 °C и 200 об/мин. Собирайте урожай при температуре 4 °C, когда OD 600 достигает 1,4-1,6 (т. е. в поздней экспоненциальной фазе), отжимая при4500 x g в течение 20 минут.
- Промойте гранулы с фосфатным буфером (0,5 М, pH 7,5).
- Ресуспендируйте ячейки в вышеупомянутом фосфатном буфере и отрегулируйте окончательный наружный диаметр600 ≈ 1,0.
- Лизируйте клетки импульсным ультразвуком в течение 1,5 мин, длительность каждого импульса 15 с. После этого шага суспензия должна быть прозрачной или менее мутной. Если нет, увеличьте количество импульсов и проверьте, прозрачна ли суспензия. После каждого импульса держите образец на льду, чтобы избежать деградации белка.
- Удалите клеточный мусор и неразрушенные клетки центрифугированием при 9 000 x g в течение 30 мин, поддерживая холодную температуру (4 °C).
- Осторожно пипеткой нанесите прозрачную надосадочную жидкость. Эта фракция содержит сырой экстракт для ферментного анализа.
- Определяют концентрацию белка сырого экстракта по методу Брэдфорда или Лоури29,30.
- Для определения активности катехин-2,3-диоксигеназы измеряют образование конечного продукта реакции (2-гидроксимюконного полуальдегида) спектрофотометром.
- Приготовьте реакционную смесь, добавив 20 мкл катехина (50 мМ), 960 мкл фосфатного буфера (50 мМ, рН 7,5) и 20 мкл сырого экстракта.
- Для отрицательного контроля замените сырой экстракт фосфатным буфером и доведите конечный объем до 1 мл.
- Инкубируют реакционную смесь в течение 30 мин. Через заданные интервалы времени измеряйте абсорбцию на длине волны 375 нм. Увеличение абсорбции свидетельствует об образовании конечного продукта реакции, полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты (2-HMS). Проведите эксперимент в трех экземплярах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Катехол чувствителен к свету и кислороду. Храните реакционную смесь в темноте и плотно закрывайте пробирки, чтобы предотвратить естественное разложение катехола.
4. Выделение геномной ДНК чистой культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Это общий протокол выделения геномной ДНК. Окрашивание по Граму проводилось на этапе сбора, обработки и анализа образцов. Из-за различий в толщине клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий метод лизиса клеток модифицируется соответствующим образом. Надевайте перчатки во время изоляции и дезинфицируйте верстак 70% этанолом, чтобы нуклеазы не разрушали ДНК. Некоторые из химических веществ, упомянутых ниже, могут вызвать серьезные ожоги кожи, поэтому при обращении с ними необходимо соблюдать надлежащую осторожность.
- Выделение геномной ДНК из грамотрицательных бактерий31.
- Выберите одну колонию и инокулируйте в свежую питательную среду в стерильные пробирки.
- Поместите пробирки в шейкер инкубатора при 200 оборотах в минуту и дайте бактериям расти в течение ночи при 30 °C.
- На следующий день гранулируйте 1,5 мл культуры, выращенной на ночь в концентрации 12 400 x g в течение 3 мин.
- Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу в 200 мкл лизисного буфера (40 мМ трис-ацетат, рН 7,8, 20 мМ ацетата натрия, 1 мМ ЭДТА, 1% SDS).
- Добавьте 66 мкл раствора NaCl (5 М) и хорошо перемешайте.
- Гранулируйте полученную смесь при 12 400 x g в течение 10 мин (4 °C).
- Пипетку прозрачной надосадочной жидкости поместите в свежую микроцентрифужную пробирку и добавьте равный объем хлороформа.
- Перемешайте раствор несколько раз, пока не появится молочный раствор.
- Отжим при 12 400 x g в течение 3 мин и перелейте надосадочную жидкость в чистый флакон.
- Добавьте 1 мл ледяного 100% этилового спирта; Перемешивайте путем инверсии до тех пор, пока белые нити ДНК не выпадут в осадок.
- Центрифугируют осажденную ДНК при 2200 x g в течение 10 мин при 4 °C и выбрасывают надосадочную жидкость.
- Промойте гранулу ДНК 1 мл 70% этанола и дайте грануле ДНК высохнуть в течение 5 минут при комнатной температуре.
- После сушки повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл 1x буфера Tris-EDTA(TE) и храните ДНК при -20 °C.
- Измерьте концентрацию (А260/280) с помощью спектрофотометра и запустите ДНК на агарозном геле (1%) для оценки качества ДНК24.
- Выделение геномной ДНК из грамположительного штамма32
- Выберите одну колонию и инокулируйте в свежую питательную среду в стерильные пробирки.
- Поместите пробирки в шейкер инкубатора при 200 оборотах в минуту и дайте бактериям расти в течение ночи при подходящей температуре роста.
- На следующий день принимают 1,5 мл выращенной культуры и центрифугируют при 8 600 х г в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в TE-буфере.
- Отрегулируйте наружный диаметр600 = 1,0 с помощью буфера TE и перенесите 740 мкл клеточной суспензии в чистую пробирку для микрофуги.
- Добавьте 20 мкл лизоцима (100 мг/мл бульона) и хорошо перемешайте пипеткой. Выдерживают при температуре 37 °C в течение 30 мин (на сухой ванне).
- Добавьте 40 мкл 10% SDS и хорошо перемешайте.
- Добавьте 8 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Хорошо перемешать и выдержать при температуре 56 °C в течение 1-3 ч (на сухой бане). Теперь суспензия должна стать прозрачной с повышенной вязкостью, отмечая эффективный лизис клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензию можно оставить на ночь, если клетки не лизированы должным образом. - Смесь CTAB/NaCl разогреть до 65 °C (в сухой ванне) и добавить 100 мкл этой смеси в клеточную суспензию. Хорошо перемешайте.
- Выдерживают при 65 °С в течение 10 мин (на сухой бане).
- Добавьте 500 мкл хлороформа:изоамилового спирта (24:1) и хорошо перемешайте. Отжим при 16 900 x g в течение 10 мин при 25 °C.
- Перелейте водную фазу в свежую микроцентрифужную пробирку, избегая органической фазы (вязкая фаза внизу).
- Осторожно добавьте 500 мкл фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и хорошо перемешайте. Отжим при 16 900 x g в течение 10 мин при 25 °C.
- Возьмите водную фазу в свежую пробирку для микроцентрифуги. Добавьте 500 мкл хлороформа:изоамилового спирта (24:1) и хорошо перемешайте.
- Переведите водную фазу и добавьте 0,6 объемного изопропанола (предварительно охлажденного при -20 °C).
- Осажденные нити ДНК должны быть видны в нитевидной форме. Выдерживать при температуре -20 °C от 2 ч до ночи.
- Центрифуга при 16 900 x g в течение 15 мин при 4 °C для гранулирования ДНК.
- Осторожно сцедите изопропанол и промойте гранулы 1 мл холодного 70% этанола (предварительно охлажденного при -20 °C), чтобы удалить любые примеси.
- Центрифуга при 16 900 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Дайте грануле высохнуть при комнатной температуре в течение 20 минут или держите пробирку при температуре 37 °C. Убедитесь, что гранула не пересушена.
- Ресуспендировать в 100 мкл 1х TE буфера и хранить ДНК при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранула пересушивается и ее трудно ресуспендировать, инкубируйте микроцентрифужную пробирку с гранулами ДНК и водой, не содержащей нуклеаз, при температуре 37 °C в течение 15-20 минут и снова ресуспендируйте с помощью пипетирования. - Измерьте концентрацию (А260/280) с помощью спектрофотометра после разведения 1:100 в буфере 1x TE и запустите ДНК на агарозном геле (1%) для оценки качества ДНК24.
5. Секвенирование 16S рРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный ниже, предназначен для амплификации и секвенирования 16S рРНК для идентификации бактерий. Информация, полученная из последовательности 16S рРНК, используется для идентификации неизвестного организма и поиска родства между различными организмами.
- Для идентификации штаммов амплифицируют ДНК, выделенную из чистых бактериальных культур методом ПЦР, с помощью универсальных праймеров, нацеленных на последовательность 16S рРНК для бактерий: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Приготовьте смесь для ПЦР (реакции 25 мкл) на льду с 18 мкл автоклавной/безнуклеазной воды, 2,5 мкл 10-кратного буфера, 0,5 мкл прямого и обратного праймеров (100 мкМ материала), 2 мкл смеси dNTPs (100 мкМ материала), 1 мкл матрицы ДНК (2-15 нг/мкл) и 1 ЕД Taq-полимеразы.
- Для амплификации гена 16S рРНК используют следующие условия циклирования: начальная денатурация при 94 °C в течение 10 мин (окончательная денатурация при 94 °C в течение 40 с, отжиг праймера при 56 °C в течение 1 мин, удлинение при 74 °C в течение 2 мин) x 30 циклов, окончательное удлинение при 74 °C в течение 10 мин.
- После завершения цикла смешайте 5 мкл образца и 1 мкл красителя с 5-кратной загрузкой ДНК. Запустите на 1% агарозном геле, чтобы проверить амплификацию. Храните продукты ПЦР при температуре 4 °C в течение короткого времени или замораживайте их при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
- Для секвенирования гена 16S рРНК установите ту же реакцию, что и выше, для большего объема (100 мкл).
- Очистите ампликоны для секвенирования по Сэнгеру24,34 с помощью набора для очистки продукта ПЦР или смешайте весь образец с красителем, загружающим ДНК, и загрузите на агарозный гель для выполнения метода гелевой экстракции.
- После завершения секвенирования преобразуйте файл результатов в формат FASTA и проверьте сходство последовательности с помощью базового инструмента поиска локального выравнивания (BLAST) на NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема, описывающая всю процедуру выделения и скрининга бактерий из водной среды обитания и их последующей идентификации методом анализа 16S рРНК, представлена на рисунке 1. Пробы воды из водно-болотных угодий в Дадри, Индия, были собраны в стерильные стеклянные бутылки и немедленно доставлены в лабораторию для обработки. Образцы пропускали через фильтрующие листы с размером пор 0,22 мкм, а фильтровальную бумагу поддерживали в контакте с различными пластинами среды. Через 2 ч фильтровальную бумагу удаляли, а планшеты инкубировали в течение ночи при 30 °C для образования колоний (рис. 2). На следующий день были отобраны отдельные колонии бактерий и нанесены полосы на планшеты со свежей средой (рис. 2). Полученная чистая культура хранилась и впоследствии использовалась для дальнейшего анализа. С помощью этого метода нам удалось создать библиотеку из более чем 100 уникальных бактериальных изолятов. Мы стремились определить бактериальные изоляты, которые могут утилизировать углеводороды, особенно стирол, который является основным компонентом одноразового пластика. Выделенные бактерии выращивали по отдельности в соответствующих средах с добавлением жидкого стирола в качестве единственного источника углерода (рис. 3). Мы смогли выделить четыре изолята, которые используют стирол в качестве единственного источника углерода. Два изолята были дополнительно охарактеризованы на предмет деградации стирола25.
Затем бактериальные изоляты были проверены на наличие ферментативных путей деградации углеводородного обмена. Метаболизм углеводородов у некоторых бактерий приводит к образованию катехинов в качестве промежуточных продуктов, которые в дальнейшем разрушаются путем орто- и метарасщепления. Ферменты катехол-1,2-диоксигеназа и катехин-2,3-диоксигеназы ответственны за реакцию расщепления кольца36. Было показано, что бактерии окружающей среды, обладающие этими ферментами, метаболизируют несколько ароматических соединений. Таким образом, для оценки HC-деградирующего потенциала бактериальных изолятов был проведен анализ деградации катехина (рис. 4). Репрезентативный анализ одного из изолятов показан на рисунке 4.
Для идентификации бактериальных изолятов проводили секвенирование 16S рРНК. Для характеристики бактерий было выполнено предварительное окрашивание по Граму, которое помогает идентифицировать и устранять неполадки на последующих этапах. Грамположительные бактерии, как правило, невосприимчивы к буферам лизиса клеток, что приводит к низкому выходу геномной ДНК37. Таким образом, результаты, полученные при окрашивании по Граму38 перед выделением геномной ДНК, помогут в выборе протокола выделения геномной ДНК. После выделения ДНК целостность геномной ДНК подтверждали визуализацией небольшого образца ДНК на агарозном геле (рис. 5А) и количественно определяли методом поглощения УФ-излучения с помощью спектрофотометра. Ген 16S рРНК амплифицировали с помощью универсальной последовательности праймеров (рис. 5Б). В то время как 500.н. необходимы для секвенирования, идеальные результаты получаются при 1300-1500.н.39. Для получения степени родства между изолированными штаммами было построено филогенетическое дерево с помощью phylogeny.fr программного обеспечения40 (рис. 6).
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс исследования Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображения колоний бактерий из проб воды. Собранную пробу воды пропускали через фильтровальную бумагу размером 0,22 мкм. Фильтровальная бумага хранилась на разных пластинах фильтрующего материала. Пластины инкубировали в течение 24-48 ч до тех пор, пока не наблюдались изолированные колонии. Затем отдельные колонии были помещены на свежие пластины для чистой изоляции культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты микробной деградации стирола и скринингового потенциала разложения углеводородов бактериями. Клетки выращивали в LCFBM с добавлением стирола 5 мМ в качестве единственного источника углерода в течение 40 дней при 30 °C и 200 об/мин. OD600 измеряли каждые 5 дней. Контрольная колба имела только LCFBM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Представление анализа фермента катехол 2,3-диоксигеназы для мониторинга деградации катехола. (А) Бесцветный субстрат катехин превращается в продукт желтого цвета под действием катехин-2,3-диоксигеназы. Реакционная смесь содержит катехин, фосфатный буфер и сырой клеточный лизат. Образование продукта обнаруживается при измерении абсорбции на длине волны 375 нм. (B) Репрезентативный график анализа фермента катехин-2,3-диоксигеназы с цельноклеточным лизатом. Реакционная смесь в отрицательном контроле имеет буфер и катехинальный субстрат без клеточного лизата. Поглощение измерялось на длине волны 375 нм с интервалом в 10 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Выделение геномной ДНК и ПЦР 16S рРНК. (А) Гель-электрофорез изолированной геномной ДНК. Дорожка M: маркер размера ДНК, дорожка 1-2: геномная ДНК. (B) Верификация гена 16S рРНК методом 1% гель-электрофореза. Гели визуализировали путем окрашивания бромидом этидия; Lane M: маркер размера ДНК (1 kb), Lane 1-4: Амплифицированные продукты ПЦР из разных штаммов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Анализ результатов секвенирования гена 16S рРНК. Построение репрезентативной дендрограммы с использованием программы phylogeny.fr для отображения родства между штаммами Exiguobacterium, выделенными из водно-болотных угодий (выделено красным прямоугольником), с известным Exiguobacterium sp. Последовательности 16S рРНК известных Exiguobacterium sp. были получены из NCBI. Эта цифра была взята из предыдущей статьи (Chauhan et.al.) без каких-либо изменений25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Пептонный дрожжевой экстракт (PYE) | |
| Пептон | 2г |
| Дрожжевой экстракт | 1г |
| 1 млн MgSO4 | 1 мл |
| 1 млн CaCl2 | 1 мл |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| Reasoner's 2A (R2A) | |
| Гидролизат казеиновой кислоты | 0,5 г |
| Дрожжевой экстракт | 0,5 г |
| Пептон протеазы | 0,5 г |
| Глюкоза | 0,5 г |
| Крахмал, растворимый | 0,5 г |
| К2ХПО4 | 0,5 г |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| М2Г | |
| 10X соли M2 (1 л) - | |
| Д/о2ХПО4 | 17,4 г |
| КХ2ПО4 | 10,6 г |
| NH4кл | 5,0 г |
| Автоклав 10X солей M2 при 121 °C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| 10X М2 соли | 100 мл |
| 50 мМ MgCl2 | 10 мл |
| 30% глюкозы (w/v) | 10 мл |
| 1 мМFeSO4 в 0,8 мМ ЭДТА, pH 6,8 | 10 мл |
| 50 мМ CaCl2 | 10 мл |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Фильтр простерилизовать. | |
| Бульон лизогении (LB) | |
| Гидролизат казеинового фермента | 10 г |
| Дрожжевой экстракт | 5 г |
| NaCl | 10 г |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| Питательный бульон (NB) | |
| Пептон | 15 г |
| Дрожжевой экстракт | 3 г |
| NaCl | 6 г |
| Глюкоза | 1 г |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| Триптический соевый бульон (TSB) | |
| Поджелудочный дайджест казеина | 17,0 г |
| Папский дайджест соевого шрота | 3 г |
| NaCl | 5 г |
| К2ХПО4 | 2,5 г |
| Глюкоза | 2,5 г |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 ° C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| М63 | |
| NH4кл | 2г |
| КХ2ПО4 | 13,6 г |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 мг |
| 20% глицерина | 10 мл |
| 1 млн MgSO4 | 1 мл |
| Дистиллированная вода | До 1000 мл |
| Минимальный носитель M9 | |
| 5X соли M9 | |
| Д/о 2 ГПО4,7Н 20 | 12,8 г |
| КХ2ПО4 | 3 г |
| NH4кл | 1 г |
| NaCl | 0,5 г |
| Дистиллированная вода | До 200 мл |
| Автоклав 5X солей M9 при 121 °C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. | |
| 1 носитель M9 | |
| 5X соли M9 | 20 мл |
| 20% глюкозы | 2 мл |
| 1 млн MgSO4 | 200 мкл |
| 1 млн CaCl2 | 10 мкл |
| Автоклавная вода | До 100 мл |
| ПРИМЕЧАНИЕ – Для приготовления твердых сред используйте 1,5% бактоагар (15 г/л) |
Таблица 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хорошо известно, что только около 1% бактерий на Земле могут быть легко культивированыв лаборатории. Даже среди культивируемых бактерий многие остаются неохарактеризованными. Совершенствование молекулярных методов придало новое измерение анализу и оценке бактериальных сообществ. Тем не менее, у таких методов есть ограничения, но они не делают культуральный анализ излишним. Методы чистого культивирования для выделения отдельных видов бактерий остаются основным механизмом характеристики физиологических свойств. Почва и водная среда обитания содержат множество бактерий с новыми ферментами и путями, которые могут быть использованы для биотехнологических целей. В этом исследовании описывается простой и недорогой метод выделения и характеризации бактерий из экологических образцов.
Разные бактерии имеют разные потребности в питательных веществах, поэтому для увеличения вероятности выделения различных видов бактерий использовались различные питательные среды. Одним из основных ограничений этого метода является то, что микробы с привередливыми требованиями к росту могут быть исключены. Также основной целью этого этапа является максимальное количество видов бактерий, полученных из образца. Количество видов бактерий в библиотеке образцов повысит шансы на выделение микробов с потенциалом биоремедиации. Несмотря на то, что мы варьируем только питательные среды, изменение температуры роста и концентрации кислорода также может увеличить шансы на дальнейшее расширение библиотеки образцов уникальными видами41,42.
Критическим этапом протокола является проверка использования испытуемого субстрата (в нашем случае стирола). Важно тщательно спланировать эксперимент для такого исследования, чтобы избежать ложноотрицательных результатов. В зависимости от характеристик роста, микроб может не сразу адаптироваться к использованию тестируемого субстрата и может потребовать процесса обогащения. В нашем случае рост бактерий в среде LCFBM, используемой для проверки использования углеводородов в качестве единственного источника углерода25, происходит медленно. Чтобы обойти эту проблему, можно начать с добавления (1% v/v) TSB или NB в среду LCFBM для поддержки роста бактерий. Идентификация культивируемого микроба осуществляется с помощью секвенирования 16S рРНК43. Этот метод является надежным и экономически эффективным методом микробной идентификации. Однако секвенирование 16S может обеспечить таксономическую идентификацию только более высокого уровня. Для идентификации конкретного вида необходимо использовать другие праймеры, специфичные для семейства, в сочетании с различными биохимическими тестами44,45.
Ферментный анализ с лизатом цельных клеток требует использования эффективного метода лизиса клеток. Лизис бактериальных клеток обычно достигается с помощью ультразвуковой обработки. Тем не менее, метод замораживания-оттаивания является альтернативным методом щадящего лизиса клеток, который, как полагают, предотвращает денатурацию белка. Процедура заключается в быстром замораживании клеток при -80 °C и оттаивании при 4 °C последовательным образом46. Добавление мягких детергентов, таких как NP-40 или Triton-X-100, также способствует лизису клеток и не денатурирует белки из-за их неионогенной природы47. Однако бактерии с толстыми клеточными стенками, такие как цианобактерии48 , могут не получить пользы от щадящего метода лизиса клеток с использованием детергентов49 , и, таким образом, метод лизиса для ферментного анализа должен быть выбран соответствующим образом.
Сосредоточив внимание на культивируемой популяции бактерий из образцов окружающей среды, исследователи могут быстро провести множество различных экспериментов. Описанные здесь методы не требуют использования очень сложных приборов и могут быть легко выполнены в стандартных лабораторных условиях. Поскольку используются углеводороды и опасные химические вещества, лаборатория должна быть оборудована для надлежащего обращения и утилизации в соответствии со стандартными операционными процедурами. Описанный здесь подход может быть легко адаптирован для изучения различных видов бактерий для многочисленных биотехнологических применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Картика Кришнана и сотрудников лаборатории RP за их полезные комментарии и предложения. DS поддерживается стипендией SNU-Doctoral fellowship и стипендией Earthwatch Institute India. RP lab поддерживается грантом CSIR-EMR и стартовыми фондами от Университета Шив Надар.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
