Summary
Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.
Abstract
Kohlenwasserstoff-Schadstoffe sind widerspenstig gegenüber dem Abbau und ihre Anreicherung in der Umwelt ist giftig für alle Lebensformen. Bakterien kodieren zahlreiche katalytische Enzyme und sind von Natur aus in der Lage, Kohlenwasserstoffe zu verstoffwechseln. Wissenschaftler nutzen die Artenvielfalt in aquatischen Ökosystemen, um Bakterien mit biologischem Abbau- und Bioremediationspotenzial zu isolieren. Solche Isolate aus der Umwelt bieten eine Vielzahl von Stoffwechselwegen und Enzymen, die weiter genutzt werden können, um den Abbauprozess im industriellen Maßstab zu skalieren. In diesem Artikel skizzieren wir den allgemeinen Prozess der Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten aus aquatischen Lebensräumen und untersuchen ihre Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle in vitro mit einfachen Techniken zu nutzen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung verschiedener Bakterienarten und deren anschließende Identifizierung mittels der 16S rRNA-Analyse. Das Protokoll enthält auch Schritte zur Charakterisierung des Kohlenwasserstoffabbaupotenzials von Bakterienisolaten. Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die versuchen, Bakterienarten aus Umwelthabitaten für ihre biotechnologischen Anwendungen zu isolieren.
Introduction
Kohlenwasserstoffe (HC) werden sowohl als Kraftstoffe als auch in chemischen Anwendungen in großem Umfang eingesetzt. Aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und Xylol werden häufig als Lösungsmittel verwendet1. Alkene wie Ethylen und Propylen dienen als Vorläufer bei der Synthese von Polyethylen- bzw. Polypropylenpolymeren. Durch die Polymerisation eines anderen Kohlenwasserstoffs, Styrol, entsteht Polystyrol. Anthropogene Aktivitäten bringen Kohlenwasserstoffe während ihrer Produktion und ihres Transports in die Umwelt ein. Die Kontamination von Boden und Wasser durch Kohlenwasserstoffe ist für die Umwelt und die menschliche Gesundheit sehr besorgniserregend. Mikroben spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Ökosystems, indem sie die biogeochemischen Kreisläufe regulieren und eine breite Palette von Substraten, zu denen auch Schadstoffe und Xenobiotika gehören, nutzen und sie in Kohlenstoff und Energiequelle umwandeln. Dieser Prozess der Entgiftung von Umweltschadstoffen durch Mikroorganismen wird als Bioremediation 3,4,5,6,7 bezeichnet.
Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe abzubauen, kommen in aquatischen und bodenständigen Lebensräumen vor 8,9,10. Es wurden viele Bakterien identifiziert, die das Potenzial haben, Alkane und aromatische HCs abzubauen, wie z. B. Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter und Oleibacter11. Die Entwicklung technologisch fortschrittlicher kulturunabhängiger Ansätze hat dazu beigetragen, neuartige HC-abbauende mikrobielle Gemeinschaften zu entdecken12. Genomisches Material, das direkt aus Quellproben isoliert wurde, wird durch Hochdurchsatzmethoden wie Next Generation Sequencing (NGS) amplifiziert und sequenziert, gefolgt von einer Analyse, so dass keine Mikroorganismen kultiviert werden müssen. NGS-Methoden, wie z. B. die Metagenomanalyse, sind teuer und leiden unter Nachteilen im Zusammenhang mit dem Amplifikationsprozess13. Kultivierungstechniken wie die selektive Anreicherungskultur14, die auf die Isolierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Mikroben abzielen, sind nach wie vor nützlich, da sie es Forschern ermöglichen, Stoffwechselwege in Bakterienisolaten zu untersuchen und zu manipulieren.
Die genomische DNA-Isolierung und die anschließende Sequenzierung des genomischen Materials liefert wertvolle Informationen über jeden Organismus. Die Sequenzierung des gesamten Genoms hilft bei der Identifizierung von Genen, die für Antibiotikaresistenzen, potenzielle Wirkstoffziele, Virulenzfaktoren, Transporter, xenobiotische metabolisierende Enzyme usw. kodieren15,16,17. Die Sequenzierung des 16SrRNA-kodierenden Gens hat sich als robuste Technik zur Identifizierung der bakteriellen Phylogenie erwiesen. Die Konservierung der Gensequenz und -funktion über die Jahre macht es zu einem zuverlässigen Werkzeug, um unbekannte Bakterien zu identifizieren und ein Isolat mit der nächstgelegenen Art zu vergleichen. Darüber hinaus ist die Länge dieses Gens optimal für die bioinformatische Analyse18. All diese Eigenschaften, zusammen mit der einfachen Genamplifikation mit universellen Primern und der Verbesserung der Gensequenzierungstechnologie, machen es zu einem Goldstandard für die Identifizierung von Mikroben.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Rückgewinnung kultivierbarer Mikroorganismen mit HC-abbauendem Potenzial aus Umweltproben. Die im Folgenden beschriebene Methode beschreibt die Sammlung und Identifizierung von HC-abbauenden Bakterien und ist in fünf Abschnitte unterteilt: (1) Sammlung von Bakterien aus Wasserproben, (2) Isolierung von Reinkulturen, (3) Untersuchung der HC-abbauenden Fähigkeit von Bakterienisolaten, (4) genomische DNA-Isolierung und (5) Identifizierung auf der Grundlage von 16S rRNA-Gensequenzierung und BLAST-Analyse. Dieses Verfahren kann zur Isolierung von Bakterien für viele verschiedene biotechnologische Anwendungen angepasst werden.
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Protocol
1. Probenentnahme, -verarbeitung und -analyse
HINWEIS: Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Einige der Isolate können pathogen sein, tragen Sie daher Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich vor und nach dem Gebrauch.
- Entnehmen Sie 500 ml Wasserprobe in fünf sterilen Glasflaschen an verschiedenen Stellen des Gewässers. Messen Sie den pH-Wert und die Temperatur jeder Probe mit einem pH-Messgerät bzw. einem Thermometer.
HINWEIS: Das Protokoll ist nicht standortspezifisch und kann leicht angepasst werden, um Organismen auch aus kohlenwasserstoffkontaminierten Gewässern zu isolieren. - Filtern Sie die Probe in einer Charge von 100 ml durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 μm unter aseptischen Bedingungen.
HINWEIS: Der Durchmesser des Filterpapiers sollte den Durchmesser der Petrischale nicht überschreiten. Zum Beispiel ist Filterpapier mit einem Durchmesser von nicht mehr als 85 mm optimal für eine Petrischale von 100-120 mm. - Bewahren Sie die Filterpapiere über verschiedenen Nährmedienplatten auf (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 und M2G22). Die verschiedenen Arten von Wachstumsmedien ermöglichen die Selektion und Anreicherung verschiedener Mikroorganismen. Die Zusammensetzungen verschiedener Nährmedien sind in Tabelle 1 aufgeführt. Verwenden Sie ein Papier für jede Medienplatte und ziehen Sie es nach 2 Stunden mit einer sterilen Pinzette ab.
- Die ungefilterten Wasserproben (10bis 6 Verdünnungen) werden nacheinander in sterilem, doppelt destilliertem Wasser verdünnt, indem 100 μl der gesammelten Wasserprobe in 900 μl steriles Wasser gegeben werden. Daraus ergibt sich eine Verdünnung von 1:10. Aus dieser Probe werden 100 μl entnommen und 900 μl steriles Wasser hinzugefügt, um eine Verdünnung von 1:100 zu erhalten. Wiederholen Sie die Verdünnung, bis die Verdünnungsfaltung 1:1.000.000 beträgt. Durch Pipettieren mischen. Das Endvolumen jeder Verdünnung beträgt 1 ml.
- Verteilen Sie 100 μl der verdünnten Wasserprobe einzeln auf alle in Schritt 3 genannten Nährmittelplatten in dreifacher Ausfertigung.
- Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 24 bis 48 Stunden, je nach Wachstum der Kolonien.
HINWEIS: Die meisten Umweltisolate wachsen bei einer optimalen Temperatur von 30 °C. Wenn Sie die Proben aus einer Umgebung mit extremen Temperaturen isolieren, inkubieren Sie die Platten bei der gleichen Temperatur wie die der Entnahmestelle. - Als nächstes pflücken Sie die Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze und führen Quadrantenstreifen durch, um isolierte Kolonien zu erhalten.
- Die Platten über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag screenen Sie die Kolonien anhand ihrer morphologischen Merkmale wie Farbe, Textur, Form, Größe, Rand, Höhe usw. Bestreifen Sie die Kolonien erneut, um Reinkulturen zu erhalten.
- Führen Sie eine Gram-Färbung jeder Reinkultur23 durch und fahren Sie mit der Glycerin-Stammvorbereitung fort.
- Zur Vorbereitung der Glycerinvorräte wird eine einzelne Kolonie in 3 ml geeigneter Wachstumsmedien geimpft und bei 30 °C inkubiert. Aus der Nachtkultur werden 700 μl entnommen und 300 μl 100%iges Glycerin (durch Autoklavieren sterilisiert) in Kryoröhrchen24 gegeben. Frieren Sie die Durchstechflaschen bei -80 °C ein, um sie langfristig zu lagern.
2. Abbau von Kohlenwasserstoffen
HINWEIS: Das folgende Beispiel dient dem Screening der Isolate, die Styrol abbauen können. Es handelt sich um eine geringfügige Modifikation der Methode, die in einem früheren Bericht25 angepasst wurde. Befolgen Sie die Schritte unter aseptischen Bedingungen.
- Wählen Sie aus einem frisch gestreiften Teller eine Kolonie aus und inokulieren Sie sie mit 5 ml tryptischer Sojabrühe (TSB)/Nährstoffbrühe (NB). Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 °C unter Schütteln bei 200 U/min, bis die Absorption ~2 erreicht.
HINWEIS: Neben TSB/NB kann jedes Wachstumsmedium gewählt werden, in dem die Bakterien eine hohe Zelldichte erreichen. - Am nächsten Tag werden die Zellen bei 2862 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entsorgt.
- Das Pellet wird zweimal mit 2 ml autoklavierter Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) gewaschen und 5 Minuten lang bei 2862 x g bei 4 °C geschleudert.
HINWEIS: Kochsalzlösung ist isotonisch und hält daher den osmotischen Druck in den Bakterienzellen aufrecht. - Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml flüssigem, kohlenstofffreiem Basalmedium (LCFBM). Messen Sie die Extinktion (OD600).
- Nehmen Sie zwei sterile Erlenmeyerkolben mit 150 ml Fassungsvermögen zur Kontrolle und die Versuchsgruppe. Beschriften Sie sie als A und B.
- In der nicht inokulierten Kontrollgruppe (Kolben A) werden 40 ml LCFBM und Styrol (5 mM) zugegeben.
- In Kolben B werden 35 ml LCFBM und Styrol zugegeben (die Endkonzentration des Styrols wird auf 5 mM eingestellt). Die Zellsuspension mit einem endgültigen ODvon 600 Zellen ≈ 0,1 zugeben und das verbleibende Volumen mit LCFBM bis zu 40 ml auffüllen. Die Kolben werden 30 Tage lang bei 30 °C unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
HINWEIS: Kohlenwasserstoffe im Übermaß können für die Mikroben giftig sein, daher beginnen Sie mit einer niedrigen Konzentration und erhöhen Sie sie allmählich. - Wiederholen Sie den obigen Vorgang für jeden weiteren Stamm, der auf Kohlenwasserstoffabbau untersucht werden muss.
- Messen Sie den OD600 jedes Kolbens alle 5 Tage und zeichnen Sie eine Wachstumskurve auf. Erhöhen Sie die Inkubationszeit auf bis zu 45 Tage, wenn die Bakterien Styrol verwerten können. Ein Anstieg von OD600 deutet darauf hin, dass das Bakterium Styrol verstoffwechseln kann.
3. Screening des Catechol-Abbaus durch Bakterienisolate
ANMERKUNG: Beim Abbau von aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Styrol, Benzol, Xylol, Naphthalin, Phenolen usw. entstehen Catechole als Reaktionszwischenprodukte. Die Catechole werden von Bakterien mit Hilfe von Catechol-1,2-Dioxygenase- und Catechol-2,3-Dioxygenase-Enzymen über die ortho- bzw. Meta-Spaltungswege weiter metabolisiert26. Diese Enzyme sind auch am Abbau anderer Kohlenwasserstoffe wie Chlorbenzol27 beteiligt. Das unten erwähnte Protokoll verwendet Ganzzelllysat für den Catechol-2-3-Dioxygenase-Enzym-Assay28. Die gleiche Lysemethode kann verwendet werden, um die Aktivität der Catechol-1,2-Dioxygenase zu screenen. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches variiert jedoch. Beide Enzyme sind von Natur aus induzierbar und können durch die Zugabe von Phenol zu den Wachstumsmedien induziert werden.
- Mit Hilfe einer sterilen Schleife wird die Bakterienkolonie von einer frisch gestreiften Platte in Mineralsalzmedium (MSM) geimpft, das mit 1-4 mM Phenol angereichert ist. Die Kultur wird bei 30 °C und 200 U/min inkubiert. Ernten Sie die Kultur bei 4 °C, wenn OD 600 zwischen 1,4 und 1,6 erreicht (d. h. in der späten exponentiellen Phase), indem Sie 20 Minuten lang bei4500 x g schleudern.
- Waschen Sie das Zellpellet mit Phosphatpuffer (0,5 M, pH 7,5).
- Resuspendieren Sie die Zellen im oben genannten Phosphatpuffer und stellen Sie den endgültigen OD600 ≈ 1,0 ein.
- Die Zellen werden durch gepulste Beschallung für 1,5 Minuten lysiert, wobei die Dauer jedes Impulses 15 s beträgt. Nach diesem Schritt muss die Suspension klar oder weniger trüb sein. Ist dies nicht der Fall, erhöhen Sie die Anzahl der Impulse und prüfen Sie, ob die Aufhängung frei ist. Bewahren Sie die Probe nach jedem Impuls auf Eis auf, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
- Die Zelltrümmer und ungebrochenen Zellen werden durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 30 Minuten unter Beibehaltung der kalten Temperatur (4 °C) entfernt.
- Pipettieren Sie den klaren Überstand vorsichtig. Diese Fraktion enthält den Rohextrakt für den Enzym-Assay.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Rohextrakts entweder nach der Bradford- oder nach der Lowry-Methode29,30.
- Um die Aktivität der Catechol-2,3-Dioxygenase zu bestimmen, wird die Bildung des Reaktionsendprodukts (2-Hydroxymucon-Semialdehyd) mit einem Spektralphotometer gemessen.
- Die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von 20 μl Catechol (50 mM), 960 μl Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) und 20 μl des Rohextrakts hergestellt.
- Für die Negativkontrolle wird der Rohextrakt durch Phosphatpuffer ersetzt und das Endvolumen auf 1 ml eingestellt.
- Die Reaktionsmischung wird 30 min lang inkubiert. In festgelegten Zeitintervallen wird die Absorption bei 375 nm gemessen. Eine Erhöhung der Absorption deutet auf die Bildung des Reaktionsendprodukts 2-Hydroxymuconsäure-Semialdehyd (2-HMS) hin. Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausführung durch.
HINWEIS: Catechol ist lichtempfindlich und sauerstoffempfindlich. Lagern Sie das Reaktionsgemisch im Dunkeln und verschließen Sie die Röhrchen fest, um den natürlichen Abbau von Catechol zu verhindern.
4. Genomische DNA-Isolierung der Reinkultur
HINWEIS: Dies ist das allgemeine Protokoll für die Isolierung genomischer DNA. Die Gram-Färbung wurde während der Probenentnahme, -verarbeitung und -analyse durchgeführt. Aufgrund der Variation der Zellwanddicke von grampositiven und gramnegativen Bakterien wird die Zelllysemethode entsprechend modifiziert. Tragen Sie während der Isolierung Handschuhe und desinfizieren Sie die Werkbank mit 70%igem Ethanol, um zu vermeiden, dass die Nukleasen die DNA abbauen. Einige der unten genannten Chemikalien können schwere Verbrennungen auf der Haut verursachen und müssen beim Umgang mit ihnen mit der gebotenen Vorsicht behandelt werden.
- Isolierung genomischer DNA aus gramnegativen Bakterien31.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und inokulieren Sie sie in einem frischen Nährmedium in sterilen Reagenzgläsern.
- Stellen Sie die Röhrchen bei 200 U/min in einen Inkubatorschüttler und lassen Sie die Bakterien über Nacht bei 30 °C wachsen.
- Am nächsten Tag 1,5 ml über Nacht gewachsene Kultur bei 12.400 x g für 3 Minuten pelletieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl Lysepuffer (40 mM Trisacetat, pH 7,8, 20 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, 1 % SDS).
- 66 μl NaCl-Lösung (5 m) zugeben und gut mischen.
- Die resultierende Mischung wird bei 12.400 x g für 10 min (4 °C) pelletiert.
- Pipettieren Sie den klaren Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform hinzu.
- Mischen Sie die Lösung mehrmals, bis eine milchige Lösung beobachtet wird.
- Bei 12.400 x g 3 min schleudern und den Überstand in ein sauberes Fläschchen überführen.
- Fügen Sie 1 ml eiskaltes 100%iges Ethanol hinzu; durch Inversion mischen, bis weiße DNA-Stränge ausfallen.
- Die gefällte DNA wird bei 2.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Waschen Sie das DNA-Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol und lassen Sie das DNA-Pellet 5 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen.
- Nach dem Trocknen wird das Pellet in 100 μl 1x Tris-EDTA(TE)-Puffer resuspendiert und die DNA bei -20 °C gelagert.
- Messen Sie die Konzentration (A260/280) mit einem Spektralphotometer und lassen Sie die DNA auf Agarose-Gel (1%) laufen, um die Qualität von DNA24 zu beurteilen.
- Isolierung genomischer DNA aus grampositivem Stamm32
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie sie in frischem Nährmedium in sterilen Reagenzgläsern.
- Legen Sie die Röhrchen mit 200 U/min in einen Inkubatorschüttler und lassen Sie die Bakterien über Nacht bei einer geeigneten Wachstumstemperatur wachsen.
- Am nächsten Tag werden 1,5 ml der gewachsenen Kultur entnommen und 5 Minuten lang bei 8.600 x g zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im TE-Puffer.
- Stellen Sie den OD600 = 1,0 mit TE-Puffer ein und überführen Sie 740 μl der Zellsuspension in ein sauberes Mikrofugenröhrchen.
- Fügen Sie 20 μl Lysozym (100 mg/ml Brühe) hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Bei 37 °C für 30 min (im Trockenbad) inkubieren.
- Fügen Sie 40 μl 10% SDS hinzu und mischen Sie es gut.
- Fügen Sie 8 μl Proteinase K (10 mg/ml) hinzu. Gut mischen und bei 56 °C 1-3 h (im Trockenbad) inkubieren. Die Suspension sollte nun mit erhöhter Viskosität deutlich werden, was eine effiziente Zelllyse kennzeichnet.
HINWEIS: Die Suspension kann über Nacht belassen werden, wenn die Zellen nicht richtig lysiert werden. - Das CTAB/NaCl-Gemisch wird auf 65 °C (in einem trockenen Bad) vorgewärmt und 100 μl dieser Mischung zur Zellsuspension gegeben. Gut mischen.
- Bei 65 °C für 10 min (im Trockenbad) inkubieren.
- 500 μl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) zugeben und gut vermischen. Bei 16.900 x g 10 min bei 25 °C schleudern.
- Die wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen und dabei die organische Phase (viskose Phase am Boden) vermeiden.
- 500 μl Phenol:Chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) vorsichtig zugeben und gut mischen. Bei 16.900 x g 10 min bei 25 °C schleudern.
- Nehmen Sie die wässrige Phase in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen. 500 μl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) zugeben und gut vermischen.
- Die wässrige Phase wird überführt und 0,6 Vol.-Isopropanol (vorgekühlt auf -20 °C) zugegeben.
- Die präzipitierten DNA-Stränge müssen in fadenförmiger Form sichtbar sein. Bei -20 °C für 2 h bis über Nacht inkubieren.
- Bei 16.900 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die DNA zu pelletieren.
- Dekantieren Sie das Isopropanol vorsichtig und waschen Sie das Pellet mit 1 ml kaltem 70%igem Ethanol (vorgekühlt auf -20 °C), um alle Verunreinigungen zu entfernen.
- Bei 16.900 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- Lassen Sie das Pellet 20 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen oder bewahren Sie das Röhrchen bei 37 °C auf. Achten Sie darauf, dass das Pellet nicht übertrocknet ist.
- Resuspendieren Sie die DNA in 100 μl 1x TE-Puffer und lagern Sie die DNA bei -20 °C.
HINWEIS: Wenn das Pellet übertrocknet und schwer resuspendiert werden kann, inkubieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA-Pellet und nukleasefreiem Wasser bei 37 °C für 15-20 Minuten und resuspendieren Sie es erneut durch Pipettieren. - Messen Sie die Konzentration (A260/280) mit einem Spektralphotometer nach einer Verdünnung von 1:100 in 1x TE-Puffer und lassen Sie die DNA auf Agarose-Gel (1%) laufen, um die Qualität von DNA24 zu beurteilen.
5. 16S rRNA-Sequenzierung
HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll gilt für die Amplifikation und Sequenzierung von 16S rRNA zur Identifizierung von Bakterien. Informationen, die aus der 16S-rRNA-Sequenz abgeleitet werden, werden verwendet, um einen unbekannten Organismus zu identifizieren und die Verwandtschaft zwischen verschiedenen Organismen zu finden.
- Um die Stämme zu identifizieren, wird die aus den reinen Bakterienkulturen isolierte DNA mittels PCR mit universellen Primern amplifiziert, die auf die 16S-rRNA-Sequenz für Bakterien abzielen: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') und 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- Bereiten Sie die PCR-Mischung (25-μl-Reaktionen) auf Eis mit 18 μl autoklaviertem/nukleasefreiem Wasser, 2,5 μl 10-fachem Puffer, 0,5 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimern (100 μM-Stamm), 2 μl dNTPs-Mischung (100 μM-Stamm), 1 μl DNA-Template (2-15 ng/μl) und 1 U Taq-Polymerase vor.
- Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen für die 16S rRNA-Genamplifikation: Anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 10 min, (abschließende Denaturierung bei 94 °C für 40 s, Primer-Annealing bei 56 °C für 1 min, Verlängerung bei 74 °C für 2 min) x 30 Zyklen, endgültige Denaturierung bei 74 °C für 10 min.
- Mischen Sie nach Beendigung des Zyklus 5 μl Probe und 1 μl 5x DNA-Beladungsfarbstoff. Tragen Sie 1%iges Agarose-Gel auf, um die Amplifikation zu überprüfen. Lagern Sie die PCR-Produkte kurzzeitig bei 4 °C oder frieren Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -20°C ein.
- Richten Sie für die 16S-rRNA-Gensequenzierung die gleiche Reaktion wie oben beschrieben für ein höheres Volumen (100 μl) ein.
- Reinigen Sie die Amplikons für die Sanger-Sequenzierung24,34 mit einem PCR-Produktreinigungskit oder mischen Sie die gesamte Probe mit DNA-Ladefarbstoff und laden Sie ein Agarose-Gel, um die Gelextraktionsmethode durchzuführen.
- Sobald die Sequenzierung abgeschlossen ist, konvertieren Sie die Ergebnisdatei in das FASTA-Format und überprüfen Sie die Sequenzähnlichkeit mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) auf NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Verfahren zur Isolierung und zum Screening von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen und deren anschließende Identifizierung durch 16S rRNA-Analyse. Wasserproben aus einem Feuchtgebiet in Dadri, Indien, wurden in sterilen Glasflaschen gesammelt und sofort zur Verarbeitung ins Labor gebracht. Die Proben wurden durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 μm geleitet, und die Filterpapiere wurden in Kontakt mit verschiedenen Medienplatten gehalten. Nach 2 h wurden die Filterpapiere entfernt und die Platten wurden über Nacht bei 30 °C inkubiert, um Kolonien zu bilden (Abbildung 2). Am nächsten Tag wurden einzelne Bakterienkolonien selektiert und auf frischen Medienplatten gestreift (Abbildung 2). Die erzeugte Reinkultur wurde eingelagert und anschließend für die weitere Analyse verwendet. Mit dieser Methode konnten wir eine Bibliothek mit mehr als 100 einzigartigen Bakterienisolaten erstellen. Unser Ziel war es, Bakterienisolate zu identifizieren, die Kohlenwasserstoffe verwerten können, insbesondere Styrol, das der Hauptbestandteil von Einwegplastik ist. Die isolierten Bakterien wurden einzeln in den jeweiligen Medien unter Zugabe von flüssigem Styrol als einzige Kohlenstoffquelle gezüchtet (Abbildung 3). Wir konnten vier Isolate identifizieren, die Styrol als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Zwei der Isolate wurden ausführlich für den Styrolabbau25 charakterisiert.
Die Bakterienisolate wurden dann auf das Vorhandensein enzymatischer Signalwege für den Abbau des Kohlenwasserstoffstoffwechsels getestet. Der Kohlenwasserstoffstoffwechsel in einigen Bakterien führt zur Produktion von Catecholen als Zwischenprodukte, die durch ortho-Spaltungs- und Meta-Spaltungswege weiter abgebaut werden. Die Enzyme Catechol 1,2--Dioxygenase und Catechol 2,3-dioxygenase sind für die Ringspaltungsreaktion verantwortlich36. Es wurde gezeigt, dass Umweltbakterien, die diese Enzyme besitzen, mehrere aromatische Verbindungen verstoffwechseln. Daher wurde ein Catechol-Abbau-Assay durchgeführt, um das HC-abbauende Potenzial von Bakterienisolaten zu bewerten (Abbildung 4). Ein repräsentativer Assay für eines der Isolate ist in Abbildung 4 dargestellt.
Um die Bakterienisolate zu identifizieren, wurde eine 16S rRNA-Sequenzierung durchgeführt. Zur Charakterisierung der Bakterien wurde eine vorläufige Gram-Färbung durchgeführt, die bei der Identifizierung und Fehlerbehebung der nachfolgenden Schritte hilft. Grampositive Bakterien sind in der Regel widerspenstig gegenüber Zelllysepuffern, was zu einer geringen genomischen DNA-Ausbeute führt37. Daher würden die Ergebnisse der Gram-Färbung38 vor der genomischen DNA-Isolierung bei der Auswahl des Protokolls für die genomische DNA-Isolierung helfen. Nach der DNA-Isolierung wurde die Integrität der genomischen DNA durch Visualisierung einer kleinen DNA-Probe auf Agarose-Gel (Abbildung 5A) bestätigt und mittels UV-Absorptionsmethode mit einem Spektralphotometer quantifiziert. Das 16S-rRNA-Gen wurde mit einer universellen Primersequenz amplifiziert (Abbildung 5B). Während 500 bp für die Sequenzierung unerlässlich sind, werden mit 1.300-1.500 bp ideale Ergebnisse erzielt39. Um den Grad der Verwandtschaft zwischen isolierten Stämmen zu erhalten, wurde ein phylogenetischer Baum unter Verwendung der phylogeny.fr Software40 erstellt (Abbildung 6).
Abbildung 1: Schematischer Ablauf der Studie Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bilder von Bakterienkolonien aus Wasserproben. Die gesammelte Wasserprobe wurde durch 0,22 μm Filterpapier geleitet. Die Filterpapiere wurden auf verschiedenen Medienplatten aufbewahrt. Die Platten wurden 24-48 h inkubiert, bis isolierte Kolonien beobachtet wurden. Die einzelnen Kolonien wurden dann zur Isolierung der Reinkultur auf frische Platten gestreift. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse des mikrobiellen Abbaus von Styrol und des Screenings des Kohlenwasserstoffabbaupotenzials von Bakterien. Die Zellen wurden 40 Tage lang bei 30 °C und 200 U/min in LCFBM mit 5 mM Styrol als alleiniger Kohlenstoffquelle gezüchtet. OD600 wurde alle 5 Tage gemessen. Der Kontrollkolben hatte nur LCFBM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Darstellung des Catechol 2,3-Dioxygenase-Enzym-Assays zur Überwachung des Abbaus von Catechol. (A) Das farblose Substrat Catechol wird durch die Einwirkung von Catechol-2,3-Dioxygenase in ein gelb gefärbtes Produkt umgewandelt. Das Reaktionsgemisch enthält Catechol, Phosphatpuffer und Rohzelllysat. Die Bildung des Produkts wird durch Messung der Absorption bei 375 nm nachgewiesen. (B) Repräsentatives Diagramm des Catechol-2,3-Dioxygenase-Enzym-Assays mit Ganzzelllysat. Das Reaktionsgemisch in der Negativkontrolle weist Puffer und Catecholsubstrat ohne Zelllysat auf. Die Absorption wurde bei 375 nm in einem Intervall von 10 min gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Genomische DNA-Isolierung und 16S rRNA-PCR. (A) Gelelektrophorese isolierter genomischer DNA. Spur M: DNA-Größenmarker, Spur 1-2: Genomische DNA. (B) Verifizierung der 16S rRNA-Genamplifikation durch 1%ige Gelelektrophorese. Die Gele wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid visualisiert; Spur M: DNA-Größenmarker (1 kb), Spur 1-4: Amplifizierte PCR-Produkte aus verschiedenen Stämmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Analyse der Ergebnisse der 16S rRNA-Gensequenzierung. Repräsentative Dendrogramm-Konstruktion unter Verwendung des phylogeny.fr-Programms zur Darstellung der Verwandtschaft zwischen Exiguobacterium-Stämmen, die aus einem Feuchtgebiet isoliert wurden (rot markiert) mit dem bekannten Exiguobacterium sp. Die 16S rRNA-Sequenzen bekannter Exiguobacterium sp. wurden aus NCBI gewonnen. Diese Zahl wurde unverändert aus einer früheren Arbeit (Chauhan et.al.) übernommen25. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Pepton-Hefe-Extrakt (PYE) | |
| Pepton | 2g |
| Hefeextrakt | 1g |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| 1M CaCl2 | 1 ml |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| Reasoner's 2A (R2A) | |
| Caseinsäure-Hydrolysat | 0,5 g |
| Hefeextrakt | 0,5 g |
| Protease-Pepton | 0,5 g |
| Dextrose | 0,5 g |
| Stärke, löslich | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| M2G | |
| 10X M2 Salze (1L) - | |
| Na2HPO4 | 17,4 g |
| KH2PO4 | 10,6 Gramm |
| NH4Cl | 5,0 g |
| Autoklavieren Sie 10X M2 Salze bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| 10X M2 Salze | 100 ml |
| 50mM MgCl2 | 10 ml |
| 30% Glukose (w/v) | 10 ml |
| 1 mMFeSO4 in 0,8 mM EDTA, pH 6,8 | 10 ml |
| 50 mM CaCl2 | 10 ml |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| Filter sterilisieren. | |
| Lysogenese Brühe (LB) | |
| Casein-enzymatisches Hydrolysat | 10 g |
| Hefeextrakt | 5 g |
| NaCl | 10 g |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| Nährbrühe (NB) | |
| Pepton | 15 g |
| Hefeextrakt | 3 g |
| NaCl | 6 g |
| Traubenzucker | 1 g |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| Tryptische Sojabrühe (TSB) | |
| Pankreasverdau von Kasein | 17,0 g |
| Papain-Verdau von Sojamehl | 3 g |
| NaCl | 5 g |
| K2HPO4 | 2,5 g |
| Dextrose | 2,5 g |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| M63-KARTON | |
| NH4Cl | 2g |
| KH2PO4 | 13,6 Gramm |
| FeSO4.7H 2O | 0,5 mg |
| 20% Glycerin | 10 ml |
| 1M MgSO4 | 1 ml |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 1000 ml |
| M9 minimale Medien | |
| 5X M9 Salze | |
| Na2HPO4,7H 20 | 12,8 Gramm |
| KH2PO4 | 3 g |
| NH4Cl | 1 g |
| NaCl | 0,5 g |
| Destilliertes Wasser | Bis zu 200 ml |
| Autoklavieren Sie 5X M9-Salze bei 121 °C und 15 PSI für 15 Minuten. | |
| 1X M9 Medien | |
| 5X M9 Salze | 20 ml |
| 20% Glukose | 2 ml |
| 1M MgSO4 | 200 μl |
| 1M CaCl2 | 10 μl |
| Autoklaviertes Wasser | Bis zu 100 ml |
| HINWEIS – Verwenden Sie für die Herstellung fester Medien 1,5 % Bacto-Agar (15 g/l) |
Tabelle 1.
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Discussion
Es ist allgemein bekannt, dass nur etwa 1 % der Bakterien auf der Erde ohne weiteres im Labor kultiviert werdenkönnen 6. Selbst unter den kultivierbaren Bakterien bleiben viele uncharakterisiert. Verbesserungen in molekularen Methoden haben der Analyse und Bewertung von Bakteriengemeinschaften eine neue Dimension verliehen. Solche Techniken haben jedoch ihre Grenzen, aber sie machen die Kulturanalysen nicht überflüssig. Reinkulturtechniken zur Isolierung einzelner Bakterienarten sind nach wie vor der primäre Mechanismus zur Charakterisierung physiologischer Eigenschaften. Böden und aquatische Lebensräume beherbergen viele Bakterien mit neuartigen Enzymen und Signalwegen, die für biotechnologische Zwecke genutzt werden können. Diese Studie beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus ökologischen Proben.
Unterschiedliche Bakterien haben unterschiedliche Ernährungsbedürfnisse, daher wurden verschiedene Wachstumsmedien verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Isolierung verschiedener Bakterienarten zu erhöhen. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass Mikroben mit anspruchsvollen Wachstumsanforderungen ausgeschlossen werden können. Außerdem besteht das Hauptziel dieses Schritts darin, die Anzahl der aus der Probe gewonnenen Bakterienarten zu maximieren. Die Anzahl der Bakterienarten in der Probenbibliothek würde die Chancen verbessern, Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu isolieren. Obwohl wir nur die Wachstumsmedien variiert haben, können unterschiedliche Wachstumstemperaturen und Sauerstoffkonzentrationen auch die Chancen erhöhen, die Probenbibliothek mit einzigartigen Spezies weiter zu erweitern41,42.
Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Überprüfung der Verwendung des zu testenden Substrats (in unserem Fall Styrol). Es ist wichtig, das Experiment für eine solche Untersuchung sorgfältig zu gestalten, um falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden. Abhängig von den Wachstumsmerkmalen kann es sein, dass sich die Mikrobe nicht sofort an die Verwendung des zu testenden Substrats anpasst und einen Anreicherungsprozess benötigt. In unserem Fall ist das Bakterienwachstum in dem LCFBM-Medium, das verwendet wird, um die Verwendung von Kohlenwasserstoff als einzige Kohlenstoffquelle zu testen, langsam25. Um dieses Problem zu umgehen, können erste Kulturen durch Zugabe von (1% v/v) TSB oder NB zum LCFBM-Medium gestartet werden, um das Bakterienwachstum zu unterstützen. Die Identifizierung der kultivierten Mikrobe erfolgt durch 16S rRNA-Sequenzierung43. Diese Methode bietet eine robuste und kostengünstige Methode zur mikrobiellen Identifizierung. Die 16S-Sequenzierung kann jedoch nur eine taxonomische Identifizierung auf höherer Ebene ermöglichen. Für die spezifische Identifizierung auf Speziesebene müssen andere familienspezifische Primer in Kombination mit verschiedenen biochemischen Tests verwendet werden44,45.
Der Enzymassay mit Ganzzelllysat erfordert die Verwendung einer effizienten Zelllysemethode. Die bakterielle Zelllyse wird in der Regel durch Beschallung erreicht. Die Gefrier-Auftau-Methode ist jedoch eine alternative Methode zur schonenden Zelllyse, von der angenommen wird, dass sie die Denaturierung von Proteinen verhindert. Das Verfahren besteht darin, die Zellen schnell bei -80 °C einzufrieren und bei 4 °C sequentiell aufzutauen46. Die Zugabe von milden Detergenzien wie NP-40 oder Triton-X-100 unterstützt ebenfalls die Zelllyse und denaturiert die Proteine aufgrund ihrer nichtionischen Natur nicht47. Bakterien mit dicken Zellwänden, wie z. B. Cyanobakterien48 , können jedoch nicht von der schonenden Zelllysemethode unter Verwendung von Detergenzien49 profitieren, und daher muss die Lysemethode für den Enzymassay entsprechend gewählt werden.
Durch die Fokussierung auf die kultivierbare Bakterienpopulation aus Umweltproben können Forscher schnell viele verschiedene Experimente durchführen. Die hier beschriebenen Methoden erfordern nicht den Einsatz sehr anspruchsvoller Instrumente und können problemlos in einem Standard-Laboraufbau durchgeführt werden. Da Kohlenwasserstoffe und gefährliche Chemikalien verwendet werden, sollte das Labor mit einer ordnungsgemäßen Handhabung und Entsorgung gemäß den Standardarbeitsanweisungen ausgestattet sein. Der hier beschriebene Ansatz lässt sich leicht anpassen, um eine Vielzahl von Bakterienarten für zahlreiche biotechnologische Anwendungen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Karthik Krishnan und den Mitgliedern des RP-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. DS wird durch das SNU-Doctoral Fellowship und das Earthwatch Institute India Fellowship unterstützt. Das RP-Labor wird durch ein CSIR-EMR-Stipendium und Start-up-Mittel der Shiv Nadar University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
