Denne protokollen beskriver dynamikken i virusinfeksjoner ved hjelp av luciferase- og fluorescens-uttrykkende rekombinante (r)SARS-CoV-2 og et in vivo-bildebehandlingssystem (IVIS) i K18 hACE2 transgene mus for å overvinne behovet for sekundære tilnærminger som kreves for å studere SARS-CoV-2 infeksjoner in vivo.
Koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemien har vært forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Til dags dato har SARS-CoV-2 vært ansvarlig for over 242 millioner infeksjoner og mer enn 4,9 millioner dødsfall over hele verden. I likhet med andre virus krever studier av SARS-CoV-2 bruk av eksperimentelle metoder for å oppdage tilstedeværelsen av virus i infiserte celler og / eller i dyremodeller. For å overvinne denne begrensningen genererte vi rekombinante rekombinante (r)SARS-CoV-2 som uttrykker bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner. Disse reporter-uttrykkende rSARS-CoV-2 tillater sporing av virusinfeksjoner in vitro og in vivo basert på uttrykket av Nluc og Venus reporter gener. Her beskriver studien bruk av rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus for å oppdage og spore SARS-CoV-2-infeksjon i det tidligere beskrevne K18 humane angiotensinkonverterende enzymet 2 (hACE2) transgen musemodell av infeksjon ved hjelp av in vivo avbildningssystemer (IVIS). Denne rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus viser rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenisitet og viral replikasjon in vivo. Viktigst, Nluc og Venus uttrykk tillater oss å direkte spore virusinfeksjoner in vivo og ex vivo, i infiserte mus. Disse rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus representerer et utmerket alternativ for å studere biologien til SARS-CoV-2 in vivo, for å forstå virusinfeksjon og tilhørende COVID-19 sykdom, og for å identifisere effektive profylaktiske og/ eller terapeutiske behandlinger for å bekjempe SARS-CoV-2-infeksjon.
Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er et innhyllet, positivt sans, enkeltstrenget RNA-virus som tilhører Betacoronavirus-slekten i Coronaviridae-familien 1. Denne virale familien er delt inn i Alpha-, Beta-, Gamma- og Delta-coronavirus1. Alfa- og betacoronavirus smitter hovedsakelig pattedyr, mens Gamma- og Deltacoronavirus infiserer nesten utelukkende fugler2. Til dags dato har syv koronavirus (CoV) krysset artsbarrierer og dukket opp som menneskelige koronavirus (HCoV): to alfa-COVs (HCoV-229E og HCoV-NL63) og fem beta-coVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Midtøsten respiratorisk syndrom coronavirus [MERS-CoV], og SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV og SARS-CoV-2 er svært patogene, noe som forårsaker alvorlig nedre luftveisinfeksjon7. Før fremveksten av SARS-CoV-2 var det to epidemiske utbrudd forårsaket av COVs: SARS-CoV i Guangdong Providence, Kina, fra 2002-2003, med en dødsrate (CFR) på ca. 9,7%; og MERS-CoV i Midtøsten fra 2012 til i dag, med en CFR på ca 34%7,8. SARS-CoV-2 har en samlet CFR mellom 3,4% -49%, med underliggende forhold som bidrar til en høyere CFR 8,9. Siden oppdagelsen i desember 2019, i Wuhan, Kina, har SARS-CoV-2 vært ansvarlig for over 242 millioner menneskelige infeksjoner og mer enn 4,9 millioner menneskelige dødsfall over hele verden 7,10,11,12. Spesielt siden slutten av 2020 har nye SARS-CoV-2-varianter av bekymring (VoC) og varianter av interesse (VoI) påvirket viruskarakteristikker, inkludert overføring og antigenisitet 9,13, og den generelle retningen av COVID-19-pandemien. For behandling av SARS-CoV-2-infeksjoner er det for tiden bare ett USA (USA) Food and Drug Administration (FDA) terapeutisk antiviral (remdesivir) og en Emergency Use Authorization (EUA) legemiddel (baricitinib, som skal administreres i kombinasjon med remdesivir)14. Det er også 6 godkjente EUA monoklonale antistoffer: REGEN-COV (casirivimab og imdevimab, administrert sammen), sotrovimab, tocilizumab og bamlanivimab og etesevimab administrert sammen 15,16,17,18,19. Det er for tiden bare en FDA-godkjent profylaktisk vaksine, Pfizer-BioNTech, og to andre profylaktiske vaksiner (Moderna og Janssen) har blitt EUA godkjent 20,21,22,23,24. Men med den ukontrollerte infeksjonsraten og fremveksten av VoC og VoI utgjør SARS-CoV-2 fortsatt en trussel mot menneskers helse. Derfor er det nødvendig med nye tilnærminger for å identifisere effektiv profylaktikk og terapeutisk behandling for å kontrollere SARS-CoV-2-infeksjon og den fortsatt pågående COVID-19-pandemien.
Å studere SARS-CoV-2 krever arbeidskrevende teknikker og sekundære tilnærminger for å identifisere tilstedeværelsen av viruset i infiserte celler og / eller validerte dyremodeller av infeksjon. Bruken av omvendt genetikk har gjort det mulig for generering av rekombinante virus å svare på viktige spørsmål i biologien til virusinfeksjoner. For eksempel har omvendte genetikkteknikker gitt midler til å avdekke og forstå mekanismene for virusinfeksjon, patogenese og sykdom. På samme måte har omvendt genetikk tilnærminger banet vei for å konstruere rekombinante virus som mangler virusproteiner for å forstå deres bidrag i viral patogenese. I tillegg har omvendte genetikkteknikker blitt brukt til å generere rekombinante virus som uttrykker reportergener for in vitro– og in vivo-applikasjoner, inkludert identifisering av profylaktiske og / eller terapeutiske tilnærminger for behandling av virusinfeksjoner. Fluorescerende og bioluminescerende proteiner er de mest brukte reportergenene på grunn av deres følsomhet, stabilitet og enkle deteksjon basert på forbedring av ny teknologi 25,26. In vitro, fluorescerende proteiner har vist seg å tjene som et bedre alternativ for lokalisering av virus i infiserte celler, mens luciferaser er mer praktiske for kvantifiseringsstudier 27,28,29. In vivo, luciferaser foretrekkes fremfor fluorescerende proteiner for hele dyreavbildning, mens fluorescerende proteiner foretrekkes for identifisering av infiserte celler eller ex vivo-avbildning 30,31,32. Bruken av reporter-uttrykkende rekombinante virus har fungert som et kraftig verktøy for studiet av virus i mange familier, inkludert blant annet flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus og influensavirus 28,33,34,35,36.
For å overvinne behovet for sekundære tilnærminger for å studere SARS-CoV-2 og karakterisere sars-cov-2-infeksjon i sanntid, vi har generert rekombinante rekombinante (r)SARS-CoV-2 som uttrykker bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner ved hjelp av våre tidligere beskrevne bakterielle kunstige kromosomer (BAC)-basert omvendt genetikk, som opprettholdes som en enkelt kopi i E. coli for å minimere toksisitet av virussekvenser under forplantning i bakterier37,38. Spesielt viste rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenisitet in vivo. Det høye nivået av Venus-uttrykk fra rSARS-CoV-2/Venus tillot å oppdage virusinfeksjon i lungene til infiserte K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av et in vivo-bildesystem (IVIS)39. Nivåene av Venus-uttrykk korrelerte godt med virale titere som ble oppdaget i lungene, og demonstrerte muligheten for å bruke Venus-uttrykk som en gyldig surrogat av SARS-CoV-2-infeksjon. Ved hjelp av rSARS-CoV-2/Nluc var vi i stand til å spore dynamikken i virusinfeksjon i sanntid og i lengderetningen vurdere SARS-CoV-2 infeksjon in vivo ved hjelp av samme IVIS-tilnærming i K18 hACE2 transgene mus.
Denne protokollen viser muligheten for å bruke disse rSARS-CoV-2 uttrykkende reportergenene for å overvåke virusinfeksjoner in vivo. Begge reporter-uttrykkende rekombinante virus gir et utmerket verktøy for å studere SARS-CoV-2 infeksjoner in vivo. De beskrevne ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) og in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) bildesystemer representerer et utmerket alternativ for å forstå dynamikken i SARS-CoV-2 infeksjon, viral patogenese og å identifisere infiserte celler / organer p…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke medlemmer ved instituttet vårt (Texas Biomedical Research Institute) for deres innsats for å holde anleggene våre i full drift og trygge under COVID-19-pandemien. Vi vil også takke vår Institutional Biosafety Committee (IBC) og spell (IACUC) for å gjennomgå protokollene våre på en tidseffektiv måte. Vi takker Dr. Thomas Moran ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for å ha gitt SARS-CoV tverrreaktivt 1C7C7 nukleocapsid (N) proteinmonokron antistoff. SARS-CoV-2 forskning i Martinez-Sobridos laboratorium støttes for tiden av NIAID/NIH-tilskuddene RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 og R43AI165089-01; Forsvarsdepartementet (DoD) gir W81XWH2110095 og W81XWH2110103; San Antonio-partnerskapet for presisjonsterapeutisk; Texas Biomedical Research Institute Forum; University of Texas Health Science Center i San Antonio; San Antonio Medical Foundation; og av Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), et NIAID-finansiert Senter for fremragende forskning og respons (CEIRR, kontrakt # 75N93021C00014).
0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Agar | Oxoid | LP0028 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |